Biokatalyse bzw. Enzymatische Katalyse

Biokatalyse oder enzymatische Katalyse ist die Verwendung biologisch aktiver Komponenten zur Katalyse chemischer Umwandlungen. Die Biokatalyse erleichtert ein Spektrum von hauptsächlich kohlenstoffbasierten Reaktionen, die in verschiedenen Umgebungen stattfinden. Diese reichen von zellfreien, vollständig in vitro ablaufenden bis zu fermentationsvermittelten Prozessen in lebenden Zellkulturen.

Die Biokatalyse stellt aus einer Reihe von Gründen eine nützliche Alternative zur herkömmlichen chemischen Katalyse dar. Enzymatische biokatalytische Reaktionen:

• Sind hochgradig chemo-, regio- und enantiospezifisch
• Laufen oft sehr schnell ab
• Arbeiten unter milderen Bedingungen als Reaktionen mit chemischen Katalysatoren
• Beseitigen Probleme mit dem Abfall, der Toxizität und den Kosten von Metallkatalysatoren
• Verringern den mit chemischen Reaktionen verbundenen Energiebedarf

Die gezielte Entwicklung von Biokatalysatoren verbessert die Stabilität in Lösungsmitteln bei hohen Temperaturen und ermöglicht so eine breite Anwendung der Biokatalyse in der pharmazeutischen, chemischen, Biokraftstoff- und Lebensmittelindustrie.

Die Biokatalyse wird mit der „grünen“, nachhaltigen und kostengünstigen Herstellung chemischer Produkte in Verbindung gebracht. Im Vergleich zur Chemokatalyse bieten Biokatalysatoren inhärente Vorteile für die Synthese, darunter:

• Erhebliche Vielfalt an Verbindungen aus natürlichen oder gentechnisch veränderten Quellen, um ein breites Spektrum an chemischen Umwandlungen zu ermöglichen
• Spezifität biokatalytischer Reaktionen, welche die Notwendigkeit bestimmter klassischer chemischer Synthese-/Verarbeitungsstrategien wie die Verwendung von Blockierungs-/Entblockierungsgruppen, die Trennung von Enantiomerengemischen und die Aufarbeitung zur Entfernung unerwünschter Nebenprodukte verringern
• Vereinfachung der Infrastruktur und des Rohstoffbedarfs, da viele Biokatalyseprozesse in Eintopfreaktionen durchgeführt werden können und die bei der herkömmlichen chemischen Katalyse erforderlichen Reaktionsschritte entfallen  

Enzyme, die in der Biokatalyse eingesetzt werden, haben wichtige und häufig genutzte Fähigkeiten, wie z. B.:

A) An funktionelle Gruppen oder Bindungsstellen spezifische Bindung und Zielerkennung von anderen biologischen Stoffen oder kleinen Molekülen

B) Geförderte Verbindung oder Verdrängung von anderen Biologika oder kleinen Molekülen

C) Strukturelle oder elektrostatische Merkmale, die den Ionentransport erleichtern

D) Geordnete bis ungeordnete Strukturumwandlungen und damit unterschiedliche katalytische Aktivitäten

E) Allosterische oder indirekte Modifikationen, die die Aktivität des Enzyms induzieren oder unterdrücken

Die Forschung im Bereich verbesserter oder modifizierter rekombinanter Biokatalysatoren wird fortgesetzt, um ihren Nutzen in aggressiven Reaktionen zu erweitern, die Reaktionsmöglichkeiten zu verbessern und die Robustheit und Wiederverwendbarkeit der Enzyme zu erhöhen. Inzwischen sind natürliche und künstlich hergestellte Biokatalysatoren verfügbar, um wichtige chemische Umwandlungen wie die Bildung von C-C-Bindungen, die Bildung von Amidbindungen, die Bildung chiraler Amine und die C-H-Funktionalisierung durchzuführen.

Die Bandbreite der für Biotransformationen verwendeten Enzyme ist ausserordentlich gross und erstreckt sich auf praktisch alle Industriezweige, zu deren Produkten zählen Lebensmittel, Pharmazeutika, Textilien, Biokraftstoffe, Papier, Chemikalien und Haushaltsprodukte. Bei der Synthese von Feinchemikalien, Arzneimitteln und verwandten Zwischenprodukten hat sich die Biokatalyse (d. h. die enzymatische Katalyse oder enzymvermittelte Katalyse) rasch zu einer wichtigen Technologie entwickelt. Es gibt Enzyme für verschiedene Biotransformationen wie Oxidationen, Reduktionen, Additionen und Eliminierungen. 

Die sechs Hauptklassen von Enzymen und Anwendungsbeispiele: 

1. Oxidoreduktasen katalysieren molekulare Oxidationen und Reduktionen. Monooxygenase-Enzyme mit molekularem Sauerstoff ermöglichen die Bildung von C-O-Bindungen, und es wurden spezifische Enzyme entwickelt, die die Oxidation von Alkoholen, Ketonen, Aldehyden und Aminen ermöglichen. Bei den Reduktionen ermöglichen Ketoreduktasen (KREDS) und Dehydrogenasen die Synthese enantiospezifischer Alkohole. Andere Enzyme können Bindungen wie C=N reduzieren und Nitrile in Amine umwandeln. 

2. Transferasen sind nützlich, um funktionelle Gruppen von einem Molekül auf ein anderes zu übertragen. Kinasen und Phosphatasen (Hinzufügen und Entfernen von Phosphaten) sind besonders für molekulare Signalkaskaden, DNA-Replikation, RNA-Transkription und andere Funktionen wichtig. Es gibt auch viele biologisch bedeutsame Transferasen, die Funktionen erfüllen, wie z. B. die Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Amine, und die dies stereoselektiv tun können.

3. Hydrolasen katalysieren die Hydrolyse verschiedener Substrate. Nukleasen oder Proteasen sind weit verbreitet und für das Nukleinsäure- und Peptid-Recycling unerlässlich. Hydrolasen wie Lipase, Protease und Acylase wirken als Katalysatoren für Michael-1,4-Additionen, die häufig zur Bildung von C-C- und Kohlenstoff-Heteroatom-Bindungen verwendet werden.

4. Lyasen katalysieren im Allgemeinen Reaktionen durch Bildung oder Abspaltung von Doppelbindungen. Im Gegensatz zu einer Substitutionsreduktion durch Hydrolasen sind Carboxylase- oder Decarboxylase-Reaktionen in der pharmazeutischen Biokatalyse für die Addition oder Entfernung von CO₂ üblich, ebenso wie C-N-Lyasen, die zur Erzeugung von Aminosäuren einschliesslich substituierter Asparaginsäuren und Alanine verwendet werden können.

5. Isomerasen ermöglichen die Umlagerung von Atomen in einem Molekül. Isomerasen, wie z. B. Racemasen, kehren die Stereochemie am chiralen Zielkohlenstoff um, und cis-trans-Isomerasen katalysieren die Isomerisierung von cis-trans-Isomeren in Alkenen oder Cycloalkanen. Die Umwandlung von Glukose in Fruktose durch Glukose-Isomerase ist eine wichtige industrielle enzymatische Biotransformation.

6. Ligasen bilden neue chemische Bindungen, indem sie zwei Moleküle zu einem grösseren Molekül zusammenfügen. Eine der wichtigsten Anwendungen ist die Verwendung von DNA-Ligasen bei der Bildung rekombinanter DNA-Moleküle. Sie sind das Gegenstück zu Endo- oder Exonukleasen.

Produktion von Enzymkatalysatoren. Im Allgemeinen werden natürliche oder rekombinante Enzyme für die Biokatalyse zunächst durch Fermentationen synthetisiert, wobei meist Bakterien, gelegentlich aber auch Hefekulturen, verwendet werden. Obwohl Enzyme in komplexeren Säugetierzellkulturen hergestellt werden können, verfügen Bakterien und Hefen in der Regel über ausreichende und natürlich vorkommende molekulare Wege, um die für rekombinante biokatalytische Enzyme erforderliche Faltung und moderate posttranslationale Veränderungen zu erreichen. Die durch solche Fermentationen hergestellten Enzyme werden in der Regel durch Lyse oder eine andere Zerstörung der Zellstrukturen geerntet, um die rekombinanten Enzyme freizusetzen, und werden in einem ähnlichen Verfahren wie andere biologische Arzneimittel weiter gereinigt. Fermentierung, Ernte und Downstream Processing stellen eigene Herausforderungen dar, die mithilfe der Prozessanalysetechnologie (PAT) bewältigt werden können.

Stabilisierung und Immobilisierung. Die Immobilisierung von Enzymen wird eingesetzt, um stabilere, aktive und wiederverwendbare Enzyme zu erhalten. Im Allgemeinen können vernetzte Enzymaggregate (CLEAs) mit einer Reihe verschiedener fester Substrate wie Siliziumoxid, Harzen oder Polymeren wie PEG und sogar anderen Komplexen wie Lipid-Nanopartikeln (LNPs) gebildet werden. Bei einigen Anwendungen der Durchflusschemie können CLEAs auch auf Oberflächen und Sensoren gebildet werden, wie z. B. bei oberflächenverstärkten Messungen, die sowohl für analytische als auch für katalytische Zwecke eingesetzt werden. Die Herausforderungen der Synthese verwandter Komponenten, der Adsorption, der Konjugation oder anderer Assoziationen sowie der Produktstabilität und -formulierung werden durch ähnliche Lösungen wie die Lösungen, de für die Formulierung von Impfstoffen und Adjuvantien-Prozesse verwendet werden, adressiert.

Produktabscheidung und -isolierung. Nach der Biokatalyse werden CLEAs vom Produkt und den restlichen Reaktanten abgetrennt und können dann recycelt oder anderweitig aufbewahrt werden. Kleine Molekülprodukte können dann durch Filtrationen oder Chromatographieverfahren isoliert werden, obwohl viele Verfahren weiterhin durch Methoden der Kristallisation begünstigt werden. Bei Biokatalyseprodukten aus grossen Molekülen würde im Allgemeinen mit den herkömmlichen Arbeitsabläufen des Downstream Processing fortgefahren werden.

Das Verständnis der praktischen Halbwertszeit und Stabilität eines freien, substratgebundenen oder an der Oberfläche immobilisierten Enzyms kann für die Entwicklung geeigneter Biokatalyseprotokolle entscheidend sein. Entscheidungskriterien:

• Lösungsmittel – Viele natürliche Enzyme kommen mit Reaktionen in organischen Lösungsmitteln nicht zurecht. Ein sich ständig weiterentwickelndes Profil von gentechnisch veränderten oder rekombinanten Enzymen verbessert die Kompatibilität mit organischen Lösungsmitteln. Rekombinante Enzyme sind inzwischen in der Lage, Reaktionen in organischen Lösungsmitteln zu katalysieren, was zum Beispiel die Verwendung modifizierter Phosphoramidite in der Oligonukeotidsynthese ermöglicht.
• pH-Wert – Enzyme arbeiten im Allgemeinen am besten innerhalb enger pH-Bereiche und tolerieren pH-Schwankungen < 0,5 pH-Einheiten. Daher ist die Kontrolle des pH-Werts häufig ein kritischer Parameter für viele biokatalytische Reaktionen. Eine manuelle Kontrolle kann schwierig oder mühsam sein. 
• Temperatur – Natürliche Enzyme und ihre rekombinanten Gegenstücke funktionieren nur bei bestimmten Temperaturen mit recht engen Grenzen effizient. Temperaturabweichungen können zu Veränderungen in der Reaktionskinetik, der Produktausbeute oder anderen kritischen Prozessergebnissen führen.
• Gelöster Sauerstoff – Dieser kritische Prozessparameter, der vor allem für die Oxygenierung und Reduktionsreaktionen wichtig ist, wird in der Regel durch die Dosierung von Sauerstoff oder Inertgas in den Ansaug- oder Kopfraum gesteuert. Um sicherzustellen, dass Oxidoreduktase-Enzyme mit höchster Effizienz arbeiten können, ist die Optimierung der Menge und des Massentransfers von gelöstem Sauerstoff (einschliesslich der Eigenschaften der Blasen) in das Reaktionsgemisch von entscheidender Bedeutung.
• Mischen, Flüssigkeitsdynamik und Gase – Ein geeignetes Mischgerät kann einen grossen Einfluss auf den Lebenszyklus biokatalytischer Enzyme haben, insbesondere bei langen Laufzeiten in der Strömungschemie- oder bei Perfusionsmethoden. Das Scale-up von biokatalytischen Reaktionen kann suboptimal sein, wenn das Mischen unzureichend charakterisiert ist. Das Mischen ist auch für die richtige Gasverteilung und den Stoffaustausch entscheidend.
• Reaktionsstöchiometrie – Das richtige Verhältnis von Reagenzien zu Enzymen ist von entscheidender Bedeutung und kann durch Studien der statistischen Versuchsplanung(DoE) bestimmt werden, die durch Chemiereaktoren automatisiert und durch in die Prozessentwicklung integrierte PAT unterstützt werden können.

Die Entwicklung und das Scale-up biokatalytischer Reaktionen hängt von der Art der verwendeten Biokatalysatoren, Substrate, Co-Faktoren und Reaktionsbedingungen ab. Wie bei der chemischen Katalyse lässt sich diese komplexe, interdependente Matrix von Variablen am besten durch eine sorgfältige Kontrolle der Reaktionsvariablen in Verbindung mit Informationen aus analytischen Echtzeitmessungen verstehen. Ein Grossteil der Einschränkungen bei der Prozessentwicklung, beim Scale-up und bei der Datendichte moderner Prozesse ist jedoch mit der weiterhin manuellen Ausrichtung von Biokatalysereaktionen verbunden, die erhebliche Zeit- und Ressourcenkosten verursacht. Der manuelle Betrieb setzt die Anwesenheit von Personal am Bioreaktor voraus, das sich nahezu ständig um die Beobachtung, Einstellung und Probenahme kümmert, um den steigenden Anforderungen der Behörden und Institutionen an die Prozesscharakterisierung und den Technologietransfer gerecht zu werden.

Der unbeaufsichtigte Betrieb der Biokatalyse ist durch Laborautomatisierungsplattformen möglich, die auf dynamische Reaktionsbedingungen reagieren, die kontinuierlich durch integrierte Sensoren und Prozessanalysetechnologien (PAT) gemessen werden. Automatisierte Synthesereaktorplattformen ermöglichen schnellere Experimente mit einem Minimum an menschlichen Fehlern oder Eingriffen. In Verbindung mit der modularen, automatisierten Reaktorprobenahme für eine chromatografische Offline-Analyse können alle kritischen Prozessparameter (CPP) überlagert und Trends abgeleitet werden. Parameterkontroll- und Prozessanalysedaten werden automatisch in Echtzeit aufgezeichnet und für das Datenmanagement und die Archivierung strukturiert. Die geringere experimentelle Variabilität und die bessere Reproduzierbarkeit über verschiedene Reaktormassstäben erleichtern das evidenzbasierte Scale-up.

• Die automatisierten EasyMax- und OptiMax-Reaktoren spielen eine wichtige Rolle, denn sie stellen sicher, dass die Auswirkungen der Schlüsselvariablen von Biotransformationen genau kontrolliert, effektiv modelliert und aufgezeichnet werden. Zu den Schlüsselvariablen zählen die Temperatur, der pH-Wert, Mischungsgeschwindigkeiten und die Dosierung.
• Die In-situ-Spektroskopie-Technologien ReactIR und ReactRaman sind nützlich, um wichtige Reaktionsspezies in Echtzeit zu verfolgen und zu messen. ReactIR verfolgt Schlüsselanalyte in Lösung, ohne Störungen durch Schwebeteilchen wie ganze Zellen.
• ParticleTrack mit FBRM-Technologie misst die Partikelgrösse und -verteilung in heterogenen Suspensionen. Der EasyViewer erfasst In-situ-Bilder von Partikeln und führt eine Echtzeit-Bildanalyse der Systemtrübung, Form, Grösse, Morphologie, Anzahl und Verteilungen durch.
• Der EasySampler ermöglicht die vollautomatische und unbeaufsichtigte Probenahme aus chemischen Reaktionen, einschliesslich Quenchen und Verdünnen der Proben zur Vorbereitung auf die Offline-Analyse.

Der automatisierte EasyMax-Reaktor ist eine vollständige Arbeitsstation für die Parameteroptimierung in der Biokatalyse zur Unterstützung von Entwicklung, Scale-up und Durchführung. Dieses vollautomatische System ermöglicht eine präzise Kontrolle der Prozessparameter.

• Verwalten Sie CPPs einschliesslich der Identifizierung von Ausgangsmaterial, Dosierraten, Temperatur, Rühren, Kopfraum, Durchperlen, pH-Messung und Titration
• Problemlose Integration mit In-Situ-Analysen für Biokatalyse, einschliesslich ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (In-Situ-Bildanalyse) und EasySampler (automatisierte In-situ-Reaktorprobenahme)
• Lassen Sie Experimente unbeaufsichtigt ablaufen; führen Sie intelligente automatische Probennahmen durch, wenn eine Offline-Analyse erforderlich ist
• iC Software ermöglicht die automatisierte Ausführung und Steuerung aller Experimente und Peripheriegeräte sowie die vollständige Datenerfassung und -aufzeichnung

ReactIR verwendet FTIR-Spektroskopie zur Messung wässriger sowie organisch-löslicher Komponenten in Biokatalyse-Studien. ReactIR-Messungen werden durch suspendierte Feststoffe, Blasen oder andere Partikelmasse nicht beeinflusst.

ReactRaman verwendet Raman Spektroskopie für die molekulare Analyse von Partikeln und die Reaktionsanalyse.

• Überwacht mehrere Produktqualitätsattribute in situ und in Echtzeit in einem Behälter oder fliessenden Prozessstrom
• Beseitigt Verzögerungen im Zusammenhang mit der Probennahme
• Quantifiziert die Auswirkungen von Verarbeitungsschritten auf die Produktausbeute und Prozesseffizienz
• Bietet eine umsetzbare Datenanalyse für die Entscheidungsfindung und Kontrolle in Echtzeit
• Unterstützt die ICH-Richtlinien durch datenreiche Experimente und Digitalisierung
• Hilft beim Scale-up aus Forschung und Entwicklung in die Produktion
• Misst Analytkonzentrationen von nur 500 ppm in Volumina von wenigen Millilitern bis zu Tausenden von Litern

ParticleTrack mit Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-Technologie ist ein optisches Partikelanalysegerät in Form einer Sonde, das direkt in einem Gefäss eingeführt wird, um Veränderungen der Partikelgrösse und -anzahl in Echtzeit zu verfolgen. ParticleTrack verwendet Messungen der Verteilung der Partikelsehnenlänge (Chord Length Distribution, CLD) zur Gewinnung der Partikelgrössenverteilung (Particle Size Distribution, PSD).

• Partikel und Partikelstrukturen werden kontinuierlich überwacht, während sich die Versuchsbedingungen oder Parameter ändern.
• Charakterisierung der Synthese von Festphasenpartikeln, der Immobilisierung von Enzymen, der Spaltung und der damit verbundenen Prozessmorphologien
• Echtzeitverfolgung der Charge oder des kontinuierlichen Wachstums von Biokatalyseprodukten während der Biokatalyse, ohne dass eine Probennahme erforderlich ist
• Charakterisierung der Bedingungen im Partikelsystem, die sich auf die Keimbildung, Ausfällungen, Polymorphismus und andere Systemeigenschaften auswirken

Der EasyViewer ist ein Partikelgrössenanalysator in Form einer Sonde, die direkt in eine Gefäss eingeführt wird, um Bilder des Partikelsystems zu erfassen. Der EasyViewer führt eine Bildanalyse durch und misst die Partikelzahl, Grössenverteilung und Morphologie aus zeitaufgelösten Inline-Bildern des Prozesses, wodurch im Laufe der Zeit eine Trendanalyse von Populationen ermöglicht wird.

• Partikel und Partikelstrukturen werden kontinuierlich überwacht, wenn sich die Versuchsbedingungen oder Parameter ändern.
• Charakterisierung der Synthese von Festphasenpartikeln, der Immobilisierung von Enzymen, der Spaltung und der damit verbundenen Prozessmorphologien
• Messung des Stoffübergangs (K_La) durch Blasencharakterisierung
• Echtzeitverfolgung der Charge oder des kontinuierlichen Wachstums von Biokatalyseprodukten während der Kristallisation, ohne dass eine Probennahme erforderlich ist
• Charakterisierung der Bedingungen in Partikelsystemen, die sich auf die Keimbildung, Ausfällungen, Polymorphismus und andere Systemeigenschaften auswirken

ReactIR Provides Insight into Optimizing the Synthesis of the Ester

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), S. 136–147

Bei der Entwicklung komplexer Moleküle suchen Chemiker nach Möglichkeiten, mehrstufige Synthesen zu vereinfachen. Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren und bei der Aufspaltung von racemischen Verbindungen ist allgemein bekannt. In-situ-Analysetechniken sind komplementär und sehr nützlich, um die Optimierung der chemischen und biochemischen Umwandlungen in den einzelnen Syntheseschritten zu unterstützen.

In dieser Arbeit waren die Forscher an der Entwicklung einer Multikilogramm-Synthese für das Medikament Arbaclofen Placarbil beteiligt, das bei Alkoholmissbrauchsstörungen eingesetzt wird. Ein Schritt umfasste die Synthese einer wichtigen Succinat-Ester-Zwischenverbindung und die anschliessende Auflösung des Esters in ein einziges (S)-Enantiomer. Um dieses einzelne Enantiomer in ausreichenden Mengen zu erhalten, untersuchten sie zwei verschiedene Ansätze, die präparative chirale Chromatografie und die enzymatische Auflösung. Der letztgenannte Ansatz wurde als vorteilhaft erachtet, und sie fanden heraus, dass die auf Polymethacrylat immobilisierte Lipase C. antartica A (IMMCALA-T2-150 Lipase) den gangbaren Weg zum aufgelösten Ester-Succinat-Zwischenprodukt darstellt.

Bezüglich der anfänglichen Synthese des Succinatesters stellten sie fest, dass die analoge Thiocarbonatverbindung mit Sulfurylchlorid reagiert und den gewünschten Ester liefert. Um die Ausbeute des Esters zu optimieren und ein Nebenprodukt zu minimieren, wurde ReactIR eingesetzt. In-situ FTIR zeigte, dass sich bei der Reaktion zwischen der Thiocarbonatverbindung und Sulfurylchlorid eine Chlorameisensäure-Zwischenverbindung bildet, die eine begrenzte thermische Stabilität aufweist. Nach Bildung dieses Zwischenprodukts und vor der Zersetzung wurde N-Hydroxysuccinimid und anschliessend Triethylamin zugegeben. Die Zugabe von Triethylamin war stark exotherm und führte dazu, dass sich das Chlorameisensäureester-Zwischenprodukt in den gewünschten Succinatester umwandelte.

ReactIR Tracks Key Biocarbonate Concentration

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

Die Autoren fanden heraus, dass Dihydroxybenzoesäure-(De)carboxylasen-Enzyme die reversible regio-selektive ortho-(De)carboxylierung von Phenolen katalysieren und von grossem Interesse sind, da sie Carboxylierungen bei viel niedrigeren Temperaturen und Drücken durchführen als entsprechende Chemokatalysatoren. In dieser aktuellen Arbeit wird berichtet, dass 2,3-Dihydroxybenzoesäure-(De)carboxylase aus Aspergillus oryzae als Katalysator die ortho-Carboxylierung von Phenolmolekülen ermöglicht, und zwar in Verbindung mit der gleichzeitigen aminmoderierten Umwandlung des Co-Substrats CO₂ zu Bicarbonat in situ.

Die Autoren stellen fest, dass die Art des Co-Substrats CO₂ oder die hydratisierte Form Bicarbonat bei enzymatischen Carboxylierungen wichtig ist, da der Mechanismus der Substratbildung und -aktivierung das eigentliche Carboxylierungsmittel bestimmt. In ihrer Arbeit wurde ein ReactIR mit einer Diamant-ATR-Einsetzsonde verwendet, um die Bildung von Bicarbonat zu verfolgen. Als Ergebnis dieser Arbeit berichten sie über die Entwicklung von Reaktionsbedingungen, die den Umsatz sowie die Reaktionsgeschwindigkeit bei der biokatalytischen Carboxylierung von Brenzkatechin erheblich verbessern.

ReactIR Investigates Oxidative Coupling With Various Substrates and Aids in Optimizing Reaction Conditions

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599.

Die Autoren berichten über die Untersuchung der Verwendung des Pilzenzyms Laccase (Novozym 51003) für die oxidative C-C-Kopplung in phenolischen Verbindungen. Laccase hat sich als geeignet erwiesen, um Phenole, Aniline usw. unter Reduktion von O₂ zu Wasser zu Chinonen zu oxidieren. Die Laccase-Kopplung gilt in der Regel als nicht selektiv, weshalb die Autoren eine Studie zur Laccase-Oxidation in verschiedenen phenolischen Substraten initiieren, um die Wirksamkeit/Selektivität der C-C-Kopplung zu bestimmen. Sie stellten fest, dass oxidative Dimerisierungen von 2,6-disubstituierten Phenolen nicht nur hochselektiv sind, sondern sich auch deutlich skalieren lassen. Sie wiesen nach, dass das entstehende 2,6-Diisopropylphenol-Oxidationsprodukt leicht zu der analogen Biphenolverbindung reduziert werden kann.

In dieser Studie wählten die Forscher die Zielsubstrate zunächst über eine Sauerstoffmessung während der von Laccase initiierten Oxidationen aus. Anschliessend untersuchten sie mit ReactIR (in-situ-FTIR-Spektroskopie) die Effektivität und Selektivität der von der Laccase initiierten Kopplungsreaktion mit den spezifischen phenolischen Substraten und legten die optimalen Bedingungen für die Maximierung des Produkts fest. In-situ-FTIR-Studien zeigten, dass die regioselektive, symmetrische Dichinon-Synthese recht schnell ablief. Darüber hinaus ermöglichte die In-situ-FTIR die Überwachung von Polymerisationen, die durch die Laccase-Oxidationen stattfanden, und da die FTIR-ATR-Methode nur gelöste Analyten verfolgt, beeinträchtigten polymere Ausfällungen die Messung nicht.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), S. 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., “Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19”, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
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• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., … Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science, 366(6470), S. 1255–1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
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