Biocatalyse | Catalyse enzymatique

La biocatalyse, ou catalyse enzymatique, correspond à l'utilisation de composants biologiquement actifs pour catalyser des transformations chimiques. La biocatalyse facilite tout un spectre de réactions principalement centrées sur le carbone qui surviennent dans des environnements allant de ceux sans cellules et entièrement in vitro aux procédés conduits par fermentation dans une culture cellulaire vivante.

La biocatalyse constitue une alternative utile à la catalyse chimique universelle pour de nombreuses raisons. Les réactions à biocatalyseurs enzymatiques :

• Sont hautement chimio-, régio- et énantio-spécifiques
• Ont souvent une cinétique rapide
• Fonctionnent dans des conditions plus modérées que les catalyseurs chimiques
• Éliminent le problème de gaspillage, de toxicité et de coûts des catalyseurs métalliques
• Réduisent les contraintes énergétiques associées aux réactions chimiques

La conception assistée des biocatalyseurs améliore la stabilité dans les solvants à des températures élevées, ce qui permet une large adoption de la biocatalyse dans les secteurs pharmaceutique, chimique, alimentaire et des biocarburants.

La biocatalyse est associée à la fabrication de produits chimiques « verts », durables et rentables. Par rapport à la chimiocatalyse, les biocatalyseurs présentent des avantages inhérents pour la synthèse, notamment :

• Une diversité considérable des composés, provenant soit de sources de conception naturelle soit de sources de conception génétique, pour s'attaquer à un large éventail de transformations chimiques
• La spécificité des réactions biocatalytiques limitant la nécessité de certaines stratégiques classiques de traitement/synthèse chimique, comme l'utilisation de groupes bloquants/débloquants, la séparation de mélanges énantiomères et le traitement conclusif pour enlever les sous-produits indésirables
• La simplification de l'infrastructure et des exigences relatives aux matières premières, car de nombreux procédés de biocatalyse peuvent être effectués sur des réactions monocellulaires et éliminent les étapes de réaction requises par la catalyse chimique universelle  

Les enzymes utilisées dans le cadre de la biocatalyse ont des capacités importantes et fréquemment exploitées, notamment :

A) Liaisons spécifiques au site ou au groupe fonctionnel et reconnaissance de la cible des autres composants biologiques ou petites molécules

B) Association ou déplacement favorisé(e) des autres composants biologiques ou petites molécules

C) Caractéristiques structurelles ou électrostatiques qui facilitent le transport des ions

D) Transformations structurelles de l'état ordonné à désordonné et, par conséquent, des activités catalytiques variées

E) Modifications allostériques ou indirectes qui induisent ou inhibent l'activité des enzymes

Les études portant sur les biocatalyseurs de recombinaison améliorés ou modifiés continuent d'accroître leur utilité dans la chimie complexe et améliorent le champ de réaction ainsi que la fiabilité et la réutilisabilité des enzymes. Des biocatalyseurs naturels et artificiels sont désormais disponibles pour effectuer les transformations chimiques clés comme la formation de liaisons C-C et de liaisons d'amide, la formation d'amines chirales et la restructuration C-H.

La variété des enzymes utilisées pour la biotransformation est extraordinairement grande et s'applique à presque tous les secteurs industriels, notamment l'alimentaire, l'industrie pharmaceutique, les textiles, les biocarburants, le papier, les produits chimiques et les produits d'entretien ménager. Dans la synthèse des produits de chimie fine, de composés pharmaceutiques et d'intermédiaires connexes, la biocatalyse (c.-à-d. la catalyse enzymatique ou la catalyse conduite par les enzymes) s'est rapidement développée en tant que technologie habilitante. Des enzymes sont disponibles pour diverses biotransformations comme les oxydations, les réductions, les ajouts et les éliminations. 

Les six principales catégories d'enzymes et exemples d'application : 

1. Oxydoréductases catalysant les réductions et les oxydations moléculaires. Les enzymes monooxygénases avec l'oxygène moléculaire permettent la formation de liaisons C-O. De plus, des enzymes spécifiques ont été conçues de manière à permettre les oxydations des alcools, cétones, aldéhydes et amines. En ce qui concerne les réductions, les kétoréductases (KREDS) et les déhydrogénases permettent la synthèse d'alcools énantio-spécifiques. D'autres enzymes peuvent réduire les liaisons comme C-N, transformant les nitriles en amines. 

2. Les transférases sont utiles pour transférer des groupes fonctionnels d'une molécule à une autre. La kinase et les photosphatases (ajout et élimination de phosphates) sont particulièrement importantes pour les cascades de signalisation moléculaires, la réplication d'ADN, la transcription d'ARN et d'autres fonctions. Il existe également de nombreuses transférases biologiquement importantes qui offrent des fonctions comme la conversion de cétones ou d'aldéhydes en amines et qui peuvent le faire de manière stéréosélective.

3. Les hydrolases catalysent l'hydrolyse de divers substrats. Les nucléases ou protéases sont prolifiques et essentielles dans le recyclage de l'acide nucléique et du peptide. Les hydrolases comme la lipase, la protéase et l'acylase agissent comme catalyseurs pour les ajouts Michael 1,4, largement utilisés pour former des liaisons C-C et carbone-hétéroatome.

4. Les lyases catalysent généralement les réactions par la formation ou l'élimination des doubles liaisons. Différentes d'une réaction de substitution par hydrolases, les réactions de carboxylase ou de décarboxylase sont courantes dans le cadre de la biocatalyse pharmaceutique pour l'ajout ou l'élimination du CO₂, tout comme le sont les lyases C-N qui peuvent être utilisées pour générer des acides aminés, notamment des alanines et des acides aspartiques substitués.

5. Les isomérases permettent la réorganisation des atomes dans une molécule. Les isomérases, comme les racémases, inversent la stéréochimie au niveau du carbone chiral de la cible et les isomérases cis-trans catalysent l'isomérisation des isomères cis-trans dans les alcènes ou les naphtènes. La conversion du glucose en fructose via l'isomérase de glucose représente une biotransformation enzymatique industrielle majeure.

6. Les ligases forment de nouvelles liaisons chimiques en réunissant deux molécules pour créer une molécule plus grosse. L'une des applications les plus importantes est l'utilisation de l'ADN ligase dans la formation de molécules d'ADN de recombinaison. C'est le complément des endo- ou exonucléases.

Production de catalyseurs enzymatiques. Généralement, les enzymes naturelles ou de recombinaison pour la biocatalyse sont tout d'abord synthétisées par le biais de fermentations, le plus souvent en utilisant des bactéries, mais sont aussi parfois dérivées de cultures pures de levures. Même si les enzymes peuvent être produites dans des cultures de cellules de mammifère plus complexes, les bactéries et les levures contiennent généralement suffisamment de voies moléculaires survenant naturellement pour atteindre le repliement et les modifications post-translationnelles modérées nécessaires pour les enzymes biocatalytiques de recombinaison. Les enzymes produites par le biais de telles fermentations sont généralement récoltées par lyse ou une autre perturbation des structures cellulaires pour libérer les enzymes de recombinaison. Elles sont purifiées ultérieurement dans le cadre d'un procédé similaire à d'autres composés pharmaceutiques biologiques. La fermentation, la récolte et le traitement en aval présentent leurs propres difficultés qui sont palliées par l'exploitation de la technologie de procédé analytique (PAT).

Stabilisation et immobilisation. L'immobilisation des enzymes sert à obtenir des enzymes plus stables, actives et réutilisables. Généralement, des agrégats d'enzymes réticulés (AER) peuvent être formés avec plusieurs substrats solides différents comme la silice, les résines ou les polymères tels que le PEG, et même d'autres complexes comme les nanoparticules lipidiques (NPL). Pour certaines applications de chimie en flux, des AER peuvent également être formés sur les surfaces et les capteurs comme ceux utilisés dans les mesures optimisées de surface, à la fois à des fins analytiques et catalytiques. Les difficultés de la synthèse des composants connexes, des adsorptions, des conjugaisons ou d'autres associations, ainsi que la formulation et la stabilité du produit, sont compensées par des solutions similaires pour la formulation de vaccins et les procédés adjuvants.

Collecte et isolation du produit. Après la biocatalyse, les AER sont séparés du produit et des réactifs résiduels et peuvent ensuite être recyclés ou conservés selon une autre méthode. Les produits à petites molécules peuvent ensuite être isolés par le biais de filtrations ou de procédés chromatographiques, même si de nombreux procédés continuent de favoriser les méthodes de cristallisation. Les produits de biocatalyse à grosses molécules conserveraient généralement des méthodes de travail universelles de traitement en aval.

Pour la conception de protocoles de biocatalyse appropriés, il peut être essentiel de comprendre la demi-vie pratique et la stabilité de toute enzyme sans liaison, avec liaison de substrats ou immobilisée en surface. Vous devez tenir compte des éléments suivants :

• Solvants - De nombreuses enzymes naturelles luttent pour faire face aux réactions des solvants organiques. Un profil en constante évolution des enzymes artificielles ou de recombinaison améliore la compatibilité avec les conditions des solvants organiques. Les enzymes de recombinaison sont à présent capables de catalyser les réactions dans des environnements impliquant des solvants organiques, permettant, par exemple, l'utilisation de phosphoramidites modifiés dans le cadre de la synthèse d'oligonucléotide.
• pH - Les enzymes offrent généralement des performances optimales lorsqu'elles se trouvent dans des plages de pH étroites et tolèrent une variation de pH < 0,5 unité de pH. Par conséquent, le contrôle du pH est souvent un paramètre essentiel à prendre en considération pour de nombreuses réactions biocatalytiques et il peut être difficile ou pénible de le contrôler manuellement. 
• Température - Les enzymes naturelles et leurs équivalents de recombinaison fonctionnent efficacement à des températures spécifiques, avec des plages relativement étroites. Les écarts de température peuvent occasionner des changements dans la cinétique de réaction, le rendement du produit ou d'autres résultats essentiels du procédé.
• Oxygène dissous - Ce paramètre essentiel du procédé, particulièrement important pour les réactions d'oxygénation et de réduction, est généralement contrôlé par l'arrosage ou le dosage de l'espace de tête de l'oxygène ou du gaz inerte. Afin d'avoir la certitude que les enzymes d'oxydoréductase puissent fonctionner à une efficacité maximale, il est essentiel d'optimiser la quantité et le transfert de masse de l'oxygène dissous (notamment les caractéristiques de bulles) dans le mélange de réaction.
• Mélange, dynamique des fluides et gaz - Un équipement approprié de mélange peut avoir un impact considérable sur le cycle de vie des enzymes biocatalytiques, en particulier sur une longue période, sur la chimie en flux ou sur les cycles à perfusion. L'extrapolation des réactions biocatalytiques peut être sous-optimale si le mélange n'est pas suffisamment caractérisé. Le mélange est également essentiel à une distribution et un transfert de masse appropriés du gaz.
• Stœchiométrie de réaction - Il est essentiel que les rapports réactifs-enzymes soient corrects et ils peuvent être déterminés par des études de Plan d'expériences (PdE), automatisés par les réacteurs chimiques et favorisés par la PAT intégrée au développement des procédés.

Le développement et l'extrapolation des réactions biocatalytiques dépendent de la nature des biocatalyseurs spécifiques utilisés, des substrats, des cofacteurs et des conditions de réaction appliquées. Comme pour la catalyse chimique, le meilleur moyen de comprendre cette matrice complexe et interdépendante de variables est d'effectuer un contrôle attentif des variables de réaction lorsqu'elles sont combinées avec les informations issues des mesures analytiques en temps réel. Toutefois, une grande partie des contraintes de développement des procédés, d'extrapolation et de densité des données pour les procédés modernes sont liées à l'orientation manuelle continue des réactions biocatalytiques, laquelle représente un temps et des coûts de ressources considérables. L'opération manuelle implique que du personnel soit présent au niveau du bioréacteur pour la surveillance quasi-constante, les réglages et l'échantillonnage, afin de satisfaire aux exigences réglementaires et institutionnelles en hausse pour la caractérisation des procédés et le transfert technologique.

Une opération de biocatalyse sans surveillance est rendue possible grâce à des plateformes d'automatisation de laboratoire qui réagissent aux conditions de réaction dynamiques mesurées en continu par les capteurs intégrés et les technologies de procédés analytiques (PAT). Les plateformes automatisées de réaction de synthèse facilitent l'accélération de l'expérimentation en minimisant l'intervention ou les erreurs humaines. Associés à un échantillonnage automatisé et modulaire des réacteurs pour l'analyse chromatographique hors ligne, tous les paramètres essentiels du procédé (PEP) peuvent être superposés et représentés sous forme de tendances. Les données de contrôle des paramètres et d'analyse des processus sont automatiquement enregistrées en temps réel et structurées en vue de la gestion des données et de l'archivage. La diminution de la variabilité expérimentale et la hausse de la reproductibilité entre différentes échelles de réacteur simplifient encore davantage l'extrapolation basée sur les preuves.

• Les réacteurs automatisés EasyMax et OptiMax ont des rôles importants à jouer pour veiller à ce que l'impact des variables clés des biotransformations, comme la température, le pH, les taux de mélange et le dosage, soit contrôlé avec précision, modélisé efficacement et enregistré.
• Les technologies spectroscopiques in situ ReactIR et ReactRaman sont utiles pour effectuer le suivi et la mesure des espèces de réaction clés en temps réel. ReactIR effectue le suivi des analytes clés dans la solution, sans interférences dues aux particules en suspension comme les cellules entières.
• ParticleTrack avec technologie FBRM mesure la taille des particules et sa distribution dans des suspensions hétérogènes. EasyViewer prend des images in situ des particules et effectue une analyse des images en temps réel concernant la turbidité du système, la forme, la taille, la morphologie, le nombre et les distributions.
• EasySampler permet de réaliser un échantillonnage entièrement automatisé et sans surveillance des réactions chimiques, notamment la désactivation et la dilution des échantillons en vue de l'analyse hors ligne.

Le réacteur automatisé EasyMax est une station de travail complète pour l'optimisation des paramètres dans le cadre de la biocatalyse visant à favoriser le développement, l'extrapolation, l'exécution. Ce système entièrement automatisé permet d'exercer un contrôle précis des paramètres des procédés.

• Gérez les PEP, notamment l'identification des matières source, les taux de dosage, la température, l'agitation, l'espace de tête, l'arrosage, la mesure du pH et le titrage
• S'intègre aisément à l'analyse in situ pour la biocatalyse, notamment ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (analyse d'images in situ) et EasySampler (échantillonnage par réacteur in situ automatisé)
• Réalisez des expériences sans surveillance ; exécutez un échantillonnage automatisé intelligent lorsqu'une analyse hors ligne est requise
• Le logiciel iC permet l'exécution et le contrôle automatisés de l'ensemble des expériences et des équipements périphériques, ainsi que l'enregistrement complet des données et la tenue de registres

ReactIR utilise la spectroscopie FTIR pour mesurer les composants à la fois aqueux et solubles organiques dans le cadre d'études de biocatalyse. Les mesures de ReactIR ne sont pas impactées par les substances solides en suspension, les bulles ou la masse des autres particules.

ReactRaman utilise la spectroscopie Raman pour fournir une analyse moléculaire des particules et une analyse des réactions.

• Surveille plusieurs attributs de qualité du produit in situ et en temps réel dans un réservoir ou un flux de procédés fluide
• Élimine les retards associés aux échantillons ponctuels
• Quantifie l'impact des étapes de traitement sur le rendement du produit et l'efficacité du procédé
• Fournit des analyses de données exploitables pour la prise de décision et le contrôle en temps réel
• Prend en charge les directives réglementaires du CIH grâce à des expériences riches en données et à la numérisation
• Facilite l'extrapolation de la R&D jusqu'à la fabrication
• Mesure les concentrations d'analytes pouvant descendre jusqu'à 500 ppm dans des volumes allant de quelques millilitres à plusieurs milliers de litres

ParticleTrack utilise la technologie FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement). C'est un instrument équipé d'une sonde optique qui est inséré directement dans un réservoir pour procéder au suivi de l'évolution de la taille et du nombre de particules en temps réel. ParticleTrack utilise des mesures de distribution des structures cordales (DSC) pour obtenir la distribution de la taille des particules (DTP).

• Les particules et les structures de particules sont surveillées en continu, au fil des variations des paramètres et des conditions expérimentales
• Caractérisez la synthèse des particules en phase solide, l'immobilisation des enzymes, le clivage et les morphologies de procédés connexes
• Faites le suivi de la croissance continue ou en lot des produits de biocatalyse en temps réel pendant la biocatalyse, sans prélèvement d'échantillons requis
• Caractérisez les conditions du système de particules qui impactent la nucléation, les précipitations, le polymorphisme et d'autres attributs du système

EasyViewer est un analyseur de la taille des particules équipé d'une sonde qui est inséré directement dans un réservoir pour prendre des images du système de particules. EasyViewer effectue une analyse des images et détermine le nombre, la morphologie et la distribution de la taille des particules à partir d'images en ligne du procédé avec référence au temps, permettant le suivi des populations au fil du temps.

• Les particules et les structures de particules sont surveillées en continu, au fil des variations des paramètres et des conditions expérimentales
• Caractérisez la synthèse des particules en phase solide, l'immobilisation des enzymes, le clivage et les morphologies de procédés connexes
• Mesurez le transfert de masses (K_La) via la caractérisation des bulles
• Faites le suivi de la croissance continue ou en lot des produits de biocatalyse en temps réel pendant la cristallisation, sans prélèvement d'échantillons requis
• Caractérisez les conditions des systèmes de particules qui impactent la nucléation, la précipitation, le polymorphisme et d'autres attributs du système

ReactIR Provides Insight into Optimizing the Synthesis of the Ester

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147

Dans le cadre du développement des molécules complexes, les chimistes cherchent des moyens de simplifier les synthèses multi-étapes. L'utilisation des enzymes à la fois comme catalyseurs et dans la résolution des composés racémiques est bien établie. Les techniques analytiques in situ sont complémentaires et très utiles pour favoriser l'optimisation des transformations chimiques et biochimiques à chaque étape de la synthèse.

Dans cet ouvrage, les chercheurs ont participé au développement d'une synthèse de plusieurs kilogrammes pour le médicament arbaclofen placarbil, utilisé pour les problèmes d'alcoolisme. L'une des étapes impliquait la synthèse d'un composé intermédiaire clé de succinate d'ester et la résolution ultérieure de l'ester en (S)-énantiomère simple. Pour obtenir cet énantiomère simple en quantités suffisantes, ils ont étudié deux approches différentes : la chromatographie chirale préparative et la résolution enzymatique. Cette dernière approche a été jugée avantageuse et ils ont constaté que la lipase C. antartica A immobilisée sur le polyméthacrylate (lipase IMMCALA-T2-150) fournissait un chemin viable pour l'intermédiaire résolu de succinate d'ester.

Pour synthétiser initialement le succinate d'ester, ils ont observé une réaction du composé thiocarbonique analogue avec le chlorure de sulfuryle, pour obtenir l'ester escompté. Afin d'optimiser le rendement de l'ester et minimiser la formation d'un sous-produit, ReactIR a été utilisé. La FTIR in situ a révélé que, lors de la réaction entre le composé thiocarbonique et le chlorure de sulfuryle, un composé de chloroformiate intermédiaire ayant une stabilité thermique limitée se formait. Une fois cet intermédiaire formé et avant la décomposition, du N-hydroxysuccinimide a été ajouté, suivi de l'ajout de triéthylamine. L'ajout de triéthylamine a été hautement exothermique et a entraîné la transformation de l'intermédiaire de chloroformiate pour obtenir le succinate d'ester souhaité.

ReactIR Tracks Key Biocarbonate Concentration

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

Les auteurs ont observé que les enzymes de (dé)carboxylase de l'acide dihydroxybenzoïque catalysent l'ortho-(dé)carboxylation régio-sélective réversible des dérivés phénoliques et qu'elles présentent un grand intérêt puisqu'elles effectuent des carboxylations à des températures et pressions bien plus basses que les chimiocatalyseurs respectifs. Dans cet ouvrage en cours, ils affirment que la (dé)carboxylase de l'acide 2,3-dihydroxybenzoïque issue de l'Aspergillus oryzae agit comme catalyseur pour permettre l'ortho-carboxylation des molécules phénoliques. Ceci est associé à la transformation simultanée modérée des amines du CO₂ du co-substrat en bicarbonate in situ.

Les auteurs déclarent que la nature du CO₂ du co-substrat, ou du bicarbonate sous forme hydratée, est importante dans les carboxylations enzymatiques car le mécanisme de liaison et d'activation des substrats détermine l'agent de carboxylation réel. Dans leur ouvrage, un ReactIR équipé d'une sonde d'insertion ATR en diamant a été utilisé pour suivre la formation du bicarbonate. Suite à cet ouvrage, ils indiquent le développement de conditions de réaction qui améliorent nettement à la fois le taux de conversion et le taux de réaction pour la carboxylation biocatalytique du catéchol.

ReactIR Investigates Oxidative Coupling With Various Substrates and Aids in Optimizing Reaction Conditions

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599.

Les auteurs disent effectuer une investigation sur l'utilisation de la laccase d'enzyme fongique (Novozym 51003) pour le typage C-C oxydatif dans les composés phénoliques. La laccase a démontré une applicabilité pour oxyder les phénols, les anilines, etc. dans les quinones avec la réduction de l'O₂ en eau. Le typage de la laccase est généralement considéré comme non sélectif et, de ce fait, les auteurs ont initié une étude sur l'oxydation de la laccase dans divers substrats phénoliques afin de déterminer l'efficacité / la sélectivité du typage C-C. Ils ont déterminé que les dimérisations oxydatives des phénols 2,6 disubstitués étaient non seulement hautement sélectives, mais aussi capables d'être grandement extrapolées. Ils ont démontré que le produit oxydatif obtenu de phénols 2,6-isopropyliques était facile à réduire pour obtenir le composé biphénolique analogue.

Dans le cadre de cette étude, les chercheurs ont initialement sélectionné les substrats cibles par mesure de l'oxygène pendant les oxydations initiées par la laccase. Ils ont ensuite utilisé ReactIR (spectroscopie FTIR in situ) pour étudier l'efficacité et la sélectivité de la réaction de typage initiée par la laccase avec les substrats phénoliques spécifiques et pour définir les conditions optimales d'optimisation du produit. Les études de FTIR in situ ont démontré que la synthèse de diquinone symétrique et régio-sélective survenait plutôt rapidement. En outre, la FTIR in situ a permis de surveiller les polymérisations qui se produisaient via les oxydations de la laccase et, puisque la méthode FTIR-ATR effectue le suivi uniquement des analytes, les précipités polymères n'ont pas interféré avec la mesure.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., « Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19 », ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
• Gan, J., Peng, Y., Chen, Q., Hu, G., Xu, Q., Jin, L., & Xie, H. (2020). Reversible covalent chemistry of carbon dioxide unlocks the recalcitrance of cellulose for its enzymatic saccharification. Bioresource Technology, 295, 122230. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.122230
• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., … Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science, 366(6470), 1255–1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
• Nguyen, T. C., Anne-Archard, D., Cameleyre, X., Lombard, E., To, K. A., & Fillaudeau, L. (2019). Bio-catalytic hydrolysis of paper pulp using in- and ex-situ multi-physical approaches: Focus on semidilute conditions to progress towards concentrated suspensions. Biomass and Bioenergy, 122, 28–36. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.01.006
• Thompson, M. P., Peñafiel, I., Cosgrove, S. C., & Turner, N. J. (2018). Biocatalysis Using Immobilized Enzymes in Continuous Flow for the Synthesis of Fine Chemicals. Organic Process Research & Development, 23(1), 9–18. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.8b00305
• Hugentobler, K. G., Rasparini, M., Thompson, L. A., Jolley, K. E., Blacker, A. J., & Turner, N. J. (2017). Comparison of a Batch and Flow Approach for the Lipase-Catalyzed Resolution of a Cyclopropanecarboxylate Ester, A Key Building Block for the Synthesis of Ticagrelor. Organic Process Research & Development, 21(2), 195–199. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.6b00346
• Pečar, D., & Goršek, A. (2017). Process and kinetic characteristics of glucose oxidation catalyzed with immobilized enzyme. Reaction Kinetics, Mechanisms and Catalysis, 122(1), 43–51. https://doi.org/10.1007/s11144-017-1202-2
• Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332. https://doi.org/10.1002/biot.201700332
• Gundersen, M. T., Tufvesson, P., Rackham, E. J., Lloyd, R. C., & Woodley, J. M. (2016). A Rapid Selection Procedure for Simple Commercial Implementation of ω-Transaminase Reactions. Organic Process Research & Development, 20(3), 602–608. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.5b00159
• Hilterhaus, L., Liese, A., Kettling, U., & Antranikian, G. (2016). Applied Biocatalysis: From Fundamental Science to Industrial Applications (1st ed.). Wiley-VCH.
• Kartnaller, V., Junior, I. I., de Souza, A. V. A., Costa, I. C. R., Rezende, M. J. C., da Silva, J. F. C., & de Souza, R. O. M. A. (2016). Evaluating the kinetics of the esterification of oleic acid with homo and heterogeneous catalysts using in-line real-time infrared spectroscopy and partial least squares calibration. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 123, 41–46. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2015.09.015
• Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2015.05.011
• Ravelo, M., Fuente, E., Blanco, Á., Ladero, M., & García-Ochoa, F. (2015). Esterification of glycerol and ibuprofen in solventless media catalyzed by free CALB: Kinetic modelling. Biochemical Engineering Journal, 101, 228–236. https://doi.org/10.1016/j.bej.2015.06.002
• Gebhard, J., Sellin, D., Hilterhaus, L., & Liese, A. (2013). Online Analysis of Enzymatic Polycondensation Reactions in Bubble Column Reactors by Means of ATR-FTIR Spectroscopy. Chemie Ingenieur Technik, 85(7), 1016–1022. https://doi.org/10.1002/cite.201200248
• Costa, I. C. R., Leite, S. G. F., Leal, I. C. R., Miranda, L. S. M., & Souza, R. O. M. A. (2011). Thermal effect on the microwave assisted biodiesel synthesis catalyzed by lipases. Journal of the Brazilian Chemical Society, 22(10), 1993–1998. https://doi.org/10.1590/s0103-50532011001000022
• Troiani, V., Cluzeau, J., & Časar, Z. (2011). Application of Chemoselective Pancreatin Powder-Catalyzed Deacetylation Reaction in the Synthesis of Key Statin Side Chain Intermediate (4R,6S)-4-(tert-Butyldimethylsilyloxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydropyran-2-one. Organic Process Research & Development, 15(3), 622–630. https://doi.org/10.1021/op100341m
• Müller, J. J., Neumann, M., Scholl, P., Hilterhaus, L., Eckstein, M., Thum, O., & Liese, A. (2010). Online Monitoring of Biotransformations in High Viscous Multiphase Systems by Means of FT-IR and Chemometrics. Analytical Chemistry, 82(14), 6008–6014. https://doi.org/10.1021/ac100469t
• Gäb, J., Melzer, M., Kehe, K., Richardt, A., & Blum, M.-M. (2009). Quantification of hydrolysis of toxic organophosphates and organophosphonates by diisopropyl fluorophosphatase from Loligo vulgaris by in situ Fourier transform infrared spectroscopy. Analytical Biochemistry, 385(2), 187–193. https://doi.org/10.1016/j.ab.2008.11.012
• Trevisan, M. G., & Poppi, R. J. (2008). Direct determination of ephedrine intermediate in a biotransformation reaction using infrared spectroscopy and PLS. Talanta, 75(4), 1021–1027. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2007.12.050
• Kazarian, S. G. (2007). Enhancing high-throughput technology and microfluidics with FTIR spectroscopic imaging. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 388(3), 529–532. https://doi.org/10.1007/s00216-007-1193-3
• Iwaki, H., Wang, S., Grosse, S., Bergeron, H., Nagahashi, A., Lertvorachon, J., Yang, J., Konishi, Y., Hasegawa, Y., & Lau, P. C. K. (2006). Pseudomonad Cyclopentadecanone Monooxygenase Displaying an Uncommon Spectrum of Baeyer-Villiger Oxidations of Cyclic Ketones. Applied and Environmental Microbiology, 72(4), 2707–2720. https://doi.org/10.1128/aem.72.4.2707-2720.2006
• Yang, J., Lorrain, M.-J., Rho, D., & Lau, P. C. K. (2006). Monitoring of Baeyer-Villiger biotransformation kinetics and fingerprinting using ReactIR 4000 spectroscopy. Industrial Biotechnology, 2(2), 138–142. https://doi.org/10.1089/ind.2006.2.138
• Dadd, M. R., Sharp, D. C. A., Pettman, A. J., & Knowles, C. J. (2000). Real-time monitoring of nitrile biotransformations by mid-infrared spectroscopy. Journal of Microbiological Methods, 41(1), 69–75. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(00)00138-x
• Kohen, A., & Klinman, J. P. (2000). Protein Flexibility Correlates with Degree of Hydrogen Tunneling in Thermophilic and Mesophilic Alcohol Dehydrogenases. Journal of the American Chemical Society, 122(43), 10738–10739. https://doi.org/10.1021/ja002229k