Biocatálisis | Catálisis enzimática

La biocatálisis, o catálisis enzimática, consiste en el uso de compuestos biológicamente activos para catalizar transformaciones químicas. La biocatálisis facilita un espectro de reacciones enfocadas sobre todo en el carbono que tienen lugar en entornos que van desde procesos sin células, completamente in vitro, hasta procesos mediados por fermentación en cultivos de células vivas.

La biocatálisis constituye una útil alternativa a la catálisis química tradicional por varias razones. Las reacciones por biocatalizador enzimático:

• cuentan con una alta quimio, regio y enantioespecificidad;
• suelen ofrecer una cinética rápida;
• se llevan a cabo en condiciones más suaves que las de los catalizadores químicos;
• eliminan los problemas de desperdicios, toxicidad y costes de los catalizadores metálicos; y
• reducen las necesidades energéticas asociadas con las reacciones químicas.

El diseño dirigido de biocatalizadores mejora la estabilidad en los disolventes a temperaturas elevadas, lo que permite la adopción generalizada de la biocatálisis en las industrias farmacéutica, química, alimentaria y de los biocombustibles.

La biocatálisis se asocia con la fabricación de productos químicos rentable, sostenible y ecológica. A diferencia de la catálisis química, la biocatálisis ofrece ventajas inherentes para la síntesis, entre las que se incluyen:

• Diversidad de compuestos significativa, ya sean de fuentes naturales o diseñados genéticamente, para enfrentarse a una amplia gama de transformaciones químicas.
• Especificidad de las reacciones biocatalíticas que mitiga la necesidad de ciertas estrategias clásicas de procesamiento o síntesis química, como el uso de grupos de bloqueo o desbloqueo, la separación de mezclas enantioméricas y el tratamiento para eliminar productos secundarios no deseados.
• Simplificación de los requisitos de infraestructura y materias primas, ya que muchos procesos biocatalíticos se pueden llevar a cabo en reacciones de un solo paso y eliminan los pasos de reacción requeridos por la catálisis química tradicional.  

Las enzimas utilizadas en la biocatálisis tienen capacidades importantes de las que se hace mucho uso, entre las que se incluyen:

A) Unión de grupos funcionales o en un sitio específico y reconocimiento de objetivos de otros productos biológicos o moléculas pequeñas.

B) Asociación o desplazamiento propiciado de otros productos biológicos o moléculas pequeñas.

C) Características estructurales o electrostáticas que facilitan el transporte de iones.

D) Transformaciones estructurales de ordenadas a desordenadas y, por tanto, actividades catalíticas variadas.

E) Regulaciones alostéricas o indirectas que provocan o inhiben la actividad enzimática.

La investigación de biocatalizadores recombinantes mejorados o modificados continúa ampliando su utilidad en los complejos procesos químicos, mejorando el alcance de la reacción, la solidez de la enzima y la reutilización. Los biocatalizadores naturales y diseñados ahora están disponibles para realizar transformaciones químicas clave, como la formación de enlaces C-C, enlaces amida, aminas quirales y la funcionalización del enlace C-H.

El alcance de las enzimas utilizadas para las biotransformaciones es extraordinariamente amplio y se aplica prácticamente a todos los sectores industriales, como el alimentario, químico, farmacéutico, textil, de los biocombustibles, del papel y de los productos de limpieza doméstica. En la síntesis de productos químicos finos, productos farmacéuticos y productos intermedios relacionados, la biocatálisis (es decir, la catálisis enzimática o catálisis mediada por enzimas) ha crecido rápidamente como tecnología de apoyo. Las enzimas están disponibles para diversas biotransformaciones como oxidaciones, reducciones, adiciones y eliminaciones. 

Las seis clases principales de enzimas y sus ejemplos de aplicación: 

1. Las oxidorreductasas catalizan oxidaciones y reducciones moleculares. Las enzimas monooxigenasas con oxígeno molecular permiten la formación de enlaces C-O, y se han diseñado enzimas específicas para permitir la oxidación de alcoholes, cetonas, aldehídos y aminas. En lo que respecta a las reducciones, las cetoreductasas (KREDS) y las deshidrogenasas permiten la síntesis de alcoholes enantioespecíficos. Otras enzimas pueden reducir enlaces como el C=N, al transformar los nitrilos en aminas. 

2. Las transferasas son útiles para transferir grupos funcionales de una molécula a otra. La quinasa y las fosfatasas (adición y eliminación de fosfatos) son especialmente importantes para las cascadas de señalización molecular, la replicación del ADN, la transcripción del ARN y otras funciones. También hay muchas transferasas biológicamente significativas que cumplen funciones, como la conversión de cetonas o aldehídos en aminas, y que pueden hacerlo de forma estereoselectiva.

3. Las hidrolasas catalizan la hidrólisis de diversos sustratos. Las nucleasas o proteasas son prolíficas y esenciales en el reciclaje de ácidos nucleicos y péptidos. Las hidrolasas como la lipasa, la proteasa y la acilasa actúan como catalizadores para las adiciones 1,4 (adiciones de Michael) y se emplean de forma generalizada para formar uniones C-C y carbono-heteroátomo.

4. Las liasas, por lo general, catalizan reacciones mediante la formación o eliminación de dobles enlaces. A diferencia de una reacción de sustitución por hidrolasas, las reacciones de carboxilasa o descarboxilasa son comunes en la biocatálisis farmacéutica para la adición o eliminación de CO2₂, al igual que lo son las liasas C-N, que pueden usarse para generar aminoácidos, incluidos el ácido aspártico sustituido y las alaninas.

5. Las isomerasas permiten la reorganización de átomos en una molécula. Las isomerasas, como las racemasas, invierten la estereoquímica en el carbono quiral diana y las isomerasas cis-trans catalizan la isomerización de los isómeros cis-trans en alquenos o cicloalcanos. La conversión de glucosa en fructosa a través de la glucosa isomerasa representa una importante biotransformación enzimática industrial.

6. Las ligasas forman nuevos enlaces químicos al unir dos moléculas para formar una molécula más grande. Una de las aplicaciones más importantes es el uso de ADN ligasa en la formación de moléculas de ADN recombinante, que son el complemento de las endo o exonucleasas.

Producción de catalizadores enzimáticos. De forma general, las enzimas naturales o recombinantes para la biocatálisis se sintetizan primero mediante fermentaciones con bacterias, en su mayoría, pero también se derivan de cultivos de levadura de forma ocasional. Aunque las enzimas pueden producirse en cultivos de células de mamíferos más complejos, las bacterias y la levadura suelen contener vías moleculares suficientes y producidas de forma natural para lograr el plegamiento y las modificaciones postraduccionales moderadas necesarias para las enzimas biocatalíticas recombinantes. Las enzimas producidas a través de dichas fermentaciones se suelen extraer mediante lisis u otra alteración de las estructuras celulares para liberar las enzimas recombinantes y se purifican aún más en un proceso similar al de otros productos farmacéuticos biológicos. La fermentación, la extracción y el procesamiento posterior presentan sus propios desafíos, que se abordan aprovechando la tecnología analítica de procesos (PAT).

Estabilización e inmovilización. La inmovilización de enzimas se utiliza para obtener enzimas más estables, activas y reutilizables. De forma general, los agregados enzimáticos reticulados (CLEA) se pueden formar con diferentes sustratos sólidos, como sílice, resinas o polímeros como el polietilenglicol, e incluso otros complejos como nanopartículas lípidas (LNP). Para algunas aplicaciones de flujo química, los CLEA también se pueden formar en superficies y sensores como los que se usan en mediciones de superficie mejorada con fines tanto analíticos como catalíticos. Los desafíos de la síntesis de componentes relacionados, adsorciones, conjugaciones u otras asociaciones, así como la estabilidad y formulación del producto, se abordan con soluciones similares para la formulación de vacunas y los procesos de adyuvantes.

Captura y aislamiento de productos. Tras la biocatálisis, los CLEA se separan del producto y de los reactivos residuales y luego pueden reciclarse o, de lo contrario, retenerse. Los productos de moléculas pequeñas pueden aislarse posteriormente mediante filtraciones o procesos de cromatografía, aunque muchos procesos continúan favoreciendo los métodos de cristalización. Los productos de biocatálisis de moléculas grandes, de forma general, continuarían con los flujos de trabajo tradicionales de procesamiento posterior.

Comprender la vida media práctica y la estabilidad de cualquier enzima libre, unida al sustrato o inmovilizada en la superficie puede ser fundamental para el diseño de protocolos de biocatálisis adecuados. Los aspectos que debe tener en cuenta incluyen:

• Disolventes: muchas enzimas naturales tienen problemas para hacer frente a las reacciones de los disolventes orgánicos. El perfil en constante evolución de las enzimas diseñadas o recombinantes está mejorando la compatibilidad con las condiciones de los disolventes orgánicos. Las enzimas recombinantes ahora son capaces de catalizar reacciones en entornos de disolventes orgánicos, por ejemplo, al permitir el uso de fosforamiditas modificadas en la síntesis de oligonucleótidos.
• pH: las enzimas suelen funcionar mejor dentro de rangos de pH limitados y toleran una variación de <0,5 unidades de pH. Por lo tanto, el control del pH suele ser un parámetro fundamental que hay que tener en cuenta para muchas reacciones biocatalíticas y puede ser difícil o tedioso de controlar de forma manual. 
• Temperatura: las enzimas naturales y sus homólogas recombinantes funcionan de manera eficaz a temperaturas específicas con rangos bastante ajustados. Las desviaciones de temperatura pueden causar cambios en la cinética de la reacción, el rendimiento del producto u otros resultados fundamentales del proceso.
• Oxígeno disuelto: este parámetro esencial del proceso, de vital importancia para las reacciones de oxigenación y reducción, se suele controlar mediante el rociado o la dosificación de oxígeno o gas inerte en el espacio vacío. Para asegurar que las enzimas oxidorreductasas puedan funcionar con la máxima eficacia, es fundamental optimizar la cantidad y la transferencia de masa de oxígeno disuelto (incluidas las características de las burbujas) en la mezcla de reacción.
• Mezclado, dinámica de fluidos y gases: un aparato de mezclado adecuado puede afectar en gran medida al ciclo de vida de las enzimas biocatalíticas, especialmente en procesos de larga duración, de flujo química o de estilo de perfusión. El escalado de las reacciones biocatalíticas puede ser deficiente si la mezcla no está suficientemente caracterizada. El mezclado también es fundamental para la distribución adecuada del gas y la transferencia de masa.
• Estequiometría de la reacción: las relaciones correctas de reactivos y enzimas son fundamentales y pueden determinarse mediante estudios sobre el diseño de experimentos (DoE), automatizados por reactores químicos y con la ayuda de PAT integrada en el desarrollo del proceso.

El desarrollo y el escalado de las reacciones biocatalíticas dependen de la naturaleza de los biocatalizadores específicos utilizados, los sustratos, los cofactores y las condiciones de reacción que se apliquen. Al igual que en la catálisis química, esta matriz compleja e interdependiente de variables se comprende mejor mediante un control minucioso de las variables de reacción cuando se combina con información de mediciones analíticas en tiempo real. Sin embargo, gran parte del desarrollo de procesos, el escalado y las limitaciones de densidad de datos para los procesos modernos están vinculados a la orientación manual continua de las reacciones de biocatálisis, que tienen importantes costes de recursos y tiempo. Las operaciones manuales implican que haya personal presente en el biorreactor para la protección, ajuste y muestreo casi constantes, con el fin de satisfacer las crecientes exigencias normativas e institucionales de caracterización de procesos y transferencia de tecnología.

El funcionamiento desatendido de la biocatálisis es posible a través de plataformas de automatización del laboratorio que responden a las condiciones dinámicas de la reacción medidas continuamente a través de sensores integrados y tecnologías analíticas de procesos (PAT). Las plataformas de reactores de síntesis automatizados facilitan una experimentación más rápida con la mínima intervención o error humano. Cuando se combinan con el muestreo en un reactor modular y automatizado para el análisis cromatográfico fuera de línea, todos los parámetros críticos del proceso (CPP) pueden superponerse y analizar las tendencias. El control de parámetros y los datos analíticos de procesos se registran de forma automática en tiempo real y se estructuran para la gestión de datos y archivos. La variabilidad reducida de los experimentos y el aumento de la reproducibilidad en diferentes básculas para reactores agilizan aún más el escalado basado en pruebas.

• Los reactores automatizados EasyMax y OptiMax desempeñan funciones importantes para asegurar que el efecto de las variables clave de las biotransformaciones, como la temperatura, el pH, las tasas de mezcla y dosificación, se controlen con precisión, se modelen de forma eficaz y se registren.
• Las tecnologías espectroscópicas in situ de ReactIR y ReactRaman son útiles para supervisar y medir especies reactivas clave en tiempo real. ReactIR realiza un seguimiento de analitos clave en la solución sin que intervengan partículas suspendidas como células enteras.
• ParticleTrack, con tecnología FBRM, mide el tamaño y la distribución de las partículas en suspensiones heterogéneas. EasyViewer captura imágenes in situ de partículas y realiza análisis de imágenes en tiempo real sobre la turbidez, la forma, el tamaño, la morfología, el recuento y las distribuciones del sistema.
• EasySampler permite el muestreo de reacciones químicas completamente automatizado y sin supervisión, incluido el enfriamiento y la dilución de muestras en preparación para el análisis fuera de línea.

El reactor automatizado EasyMax es una estación de control completa para la optimización de parámetros en la biocatálisis y para respaldar el desarrollo, el escalado y la ejecución. Este sistema completamente automatizado ofrece un control preciso de los parámetros del proceso.

• Gestión de los CPP, incluida la identificación de materia prima, las tasas de dosificación, la temperatura, la agitación, el espacio vacío, el rociado, la medición del pH y la valoración.
• Integración sencilla con análisis in situ para la biocatálisis, entre las que se incluyen ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (análisis de imágenes in situ) e EasySampler (muestreo en un reactor automatizado, in situ).
• Ejecución de experimentos sin supervisión y muestreo automatizado inteligente cuando se requiere un análisis fuera de línea.
• Software iC para la ejecución y el control automatizados de todos los experimentos y el equipo periférico, así como la captación de datos completa y la conservación de registros.

ReactIR utiliza espectroscopia FTIR para medir tanto los componentes acuosos como los orgánicos solubles en estudios de biocatálisis. Las mediciones de ReactIR no se ven afectadas por sólidos en suspensión, burbujas ni por otras masas de partículas.

ReactRaman usa la espectroscopia Raman para ofrecer análisis moleculares de las partículas y análisis de reacciones.

• Supervisa múltiples atributos de calidad del producto in situ y en tiempo real en un recipiente o en un flujo de proceso.
• Elimina los retratos asociados a la recogida de muestras.
• Cuantifica el impacto de los pasos del procesamiento posterior en el rendimiento de los productos y la eficacia de los procesos.
• Proporciona datos analíticos útiles para el control y la toma de decisiones en tiempo real.
• Cumple con las directrices ICH mediante la digitalización y la experimentación con datos abundantes.
• Facilita el escalado de I+D a la fabricación.
• Mide la concentración de analito de tan solo 500 ppm en volúmenes, desde varios mililitros hasta miles de litros.

ParticleTrack usa la tecnología de medición de reflectancia con haz enfocado (FBRM) y es un instrumento óptico basado en sensores que se inserta directamente en un recipiente para realizar el seguimiento de los cambios en el tamaño de las partículas y el recuento de estas en tiempo real. ParticleTrack emplea mediciones de la distribución de la longitud de cuerda (CLD) para obtener la distribución del tamaño de las partículas (PSD).

• Las partículas y las estructuras de las partículas se controlan constantemente, ya que las condiciones o los parámetros de los experimentos varían.
• Caracterice la síntesis de partículas en fase sólida, la inmovilización de enzimas, la escisión y las morfologías de procesos relacionados.
• Realice un seguimiento de los lotes o del crecimiento continuo de los productos de la biocatálisis durante el mismo proceso en tiempo real sin necesidad de extraer muestras.
• Caracterice las condiciones del sistema de partículas que afectan a la nucleación, las precipitaciones, el polimorfismo y otros atributos del sistema.

EasyViewer es un analizador de tamaño de partículas basado en sensores que se inserta directamente en un recipiente para capturar imágenes del sistema de partículas. EasyViewer realiza análisis de imágenes y mide el recuento de partículas, la distribución del tamaño y la morfología a partir de imágenes en línea de resolución temporal del proceso, lo que permite establecer tendencias en las poblaciones a lo largo del tiempo.

• Las partículas y las estructuras de las partículas se controlan constantemente, ya que las condiciones o los parámetros de los experimentos varían.
• Caracterice la síntesis de partículas en fase sólida, la inmovilización de enzimas, la escisión y las morfologías de procesos relacionados.
• Mida la transferencia de masa (K_La) a través de la caracterización de burbujas.
• Realice un seguimiento de los lotes o del crecimiento continuo de los productos de la biocatálisis durante la cristalización en tiempo real sin necesidad de extraer muestras.
• Caracterice las condiciones de los sistemas de partículas que afectan a la nucleación, la precipitación, el polimorfismo y otros atributos del sistema.

ReactIR ofrece información sobre la optimización de la síntesis del éster

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147

En el campo del desarrollo de moléculas complejas, los químicos buscan formas de simplificar la síntesis de varios pasos. El uso de enzimas como catalizadores, así como en la resolución de compuestos racémicos está consolidado. Las técnicas analíticas in situ son complementarias y de gran utilidad para ayudar a optimizar las transformaciones químicas y bioquímicas en los pasos individuales de la síntesis.

En este trabajo, los investigadores participaron en el desarrollo de una síntesis de varios kilogramos para el fármaco arbaclofen placarbil, que se usa para los trastornos de alcoholismo. Un paso implicó la síntesis de un compuesto intermedio de éster de succinato clave y la posterior resolución del éster a un (S)-enantiómero único. Para obtener este enantiómero único en cantidades suficientes, exploraron dos enfoques diferentes: la cromatografía quiral preparativa y la resolución enzimática. Este último enfoque se consideró ventajoso y encontraron que la lipasa A de Candida antartica inmovilizada en polimetacrilato (lipasa IMMCALA-T2-150) proporcionaba la ruta viable para el intermedio succinato de éster resuelto.

Para sintetizar inicialmente el éster de succinato, descubrieron que el compuesto de tiocarbonato análogo reaccionaba con cloruro de sulfurilo para producir el éster deseado. Para optimizar el rendimiento del éster y minimizar un producto secundario, se utilizó ReactIR. El FTIR in situ mostró que cuando reaccionaban el compuesto de tiocarbonato y el cloruro de sulfurilo, se formaba un compuesto de cloroformiato intermedio que tenía una estabilidad térmica limitada. Una vez formado este intermedio y antes de la descomposición, se añadió N-hidroxisuccinimida y, luego, trietilamina. La adición de trietilamina fue altamente exotérmica y condujo a que el intermedio cloroformiato se transformara en el éster de succinato deseado.

ReactIR realiza un seguimiento de la concentración de bicarbonato clave

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

Los autores descubrieron que las enzimas (des)carboxilasas de ácido dihidroxibenzoico catalizan la orto (des)carboxilación regioselectiva reversible de fenólicos y son de gran interés, ya que realizan carboxilaciones a temperaturas y presiones mucho más bajas que los quimiocatalizadores respectivos. En este trabajo actual, informan que el ácido 2,3-dihidroxibenzoico (des)carboxilasa de Aspergillus oryzae actúa como un catalizador para permitir la orto carboxilación de moléculas fenólicas, y esto está relacionado con la transformación simultánea moderada por amina del cosustrato CO₂ a bicarbonato in situ.

Los autores afirman que la naturaleza del cosustrato CO₂, o el bicarbonato hidratado, es importante en las carboxilaciones enzimáticas, ya que el mecanismo de unión y activación del sustrato determina el agente de carboxilación real. En su trabajo, se utilizó un ReactIR equipado con un sensor de inserción de ATR de diamante para efectuar un seguimiento de la formación de bicarbonato. Como resultado de este trabajo, informan del desarrollo de condiciones de reacción que mejoran significativamente tanto la conversión como la tasa de reacción para la carboxilación biocatalítica de catecol.

ReactIR investiga el acoplamiento oxidativo con varios sustratos y ayuda a optimizar las condiciones de reacción

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599.

Los autores informan de la investigación sobre el uso de la enzima fúngica lacasa (Novozym 51003) para el acoplamiento oxidativo de C-C en compuestos fenólicos. La lacasa ha demostrado su aplicabilidad para oxidar fenoles y anilinas, entre otros, en quinonas con reducción de O₂ a agua. El acoplamiento de lacasas se considera, de forma general, no selectivo y, por lo tanto, los autores iniciaron un estudio de oxidación de lacasas en varios sustratos fenólicos para determinar la efectividad y la selectividad del acoplamiento C-C. Determinaron que las dimerizaciones oxidativas de 2,6-disustituido fenol no solo eran altamente selectivas, sino que también podían escalarse de forma significativa. Demostraron que el producto oxidativo de 2,6-diisopropilfenol resultante se redujo fácilmente al compuesto de bifenol análogo.

En este estudio, los investigadores seleccionaron inicialmente sustratos diana a través de la medición de oxígeno durante las oxidaciones iniciadas por lacasa. Luego utilizaron ReactIR (espectroscopia FTIR in situ) para investigar la efectividad y selectividad de la reacción de acoplamiento iniciada por lacasa con los sustratos fenólicos específicos y para definir las condiciones óptimas para maximizar el producto. Los estudios de FTIR in situ demostraron que la síntesis regioselectiva y simétrica de diquinonas se producía con bastante rapidez. Además, el FTIR in situ permitió el seguimiento de las polimerizaciones que se produjeron mediante las oxidaciones de lacasa, y dado que el método FTIR-ATR rastrea solo los analitos solutos, los precipitados poliméricos no interfirieron con la medición.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P. y Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., “Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19”, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
• Gan, J., Peng, Y., Chen, Q., Hu, G., Xu, Q., Jin, L., & Xie, H. (2020). Reversible covalent chemistry of carbon dioxide unlocks the recalcitrance of cellulose for its enzymatic saccharification. Bioresource Technology, 295, 122230. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.122230
• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., … Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science, 366(6470), 1255-1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
• Nguyen, T. C., Anne-Archard, D., Cameleyre, X., Lombard, E., To, K. A., & Fillaudeau, L. (2019). Bio-catalytic hydrolysis of paper pulp using in- and ex-situ multi-physical approaches: Focus on semidilute conditions to progress towards concentrated suspensions. Biomass and Bioenergy, 122, 28-36. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.01.006
• Thompson, M. P., Peñafiel, I., Cosgrove, S. C., & Turner, N. J. (2018). Biocatalysis Using Immobilized Enzymes in Continuous Flow for the Synthesis of Fine Chemicals. Organic Process Research & Development, 23(1), 9–18. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.8b00305
• Hugentobler, K. G., Rasparini, M., Thompson, L. A., Jolley, K. E., Blacker, A. J., & Turner, N. J. (2017). Comparison of a Batch and Flow Approach for the Lipase-Catalyzed Resolution of a Cyclopropanecarboxylate Ester, A Key Building Block for the Synthesis of Ticagrelor. Organic Process Research & Development, 21(2), 195–199. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.6b00346
• Pečar, D., & Goršek, A. (2017). Process and kinetic characteristics of glucose oxidation catalyzed with immobilized enzyme. Reaction Kinetics, Mechanisms and Catalysis, 122(1), 43–51. https://doi.org/10.1007/s11144-017-1202-2
• Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A. y Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332. https://doi.org/10.1002/biot.201700332
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• Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2015.05.011
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