Biocatálise | Catálise Enzimática

A biocatálise, ou catálise enzimática, é o uso de componentes biologicamente ativos para catalisar transformações químicas. A biocatálise facilita um espectro de reações centradas principalmente no carbono que ocorrem em ambientes que variam de processos isentos de células, totalmente in vitro, a processos mediados por fermentação em cultura de células vivas.

A biocatálise representa uma alternativa útil à catálise química tradicional por várias razões. Reações do biocatalisador enzimático:

• São altamente quimio-, régio- e enantioespecíficos
• Muitas vezes têm cinética rápida
• Operam em condições mais suaves do que catalisadores químicos
• Eliminam a questão de resíduos, toxicidade e custo de catalisadores de metal
• Reduzem os requisitos de energia associados a reações químicas

A engenharia dirigida de biocatalisadores melhora a estabilidade em solventes em temperaturas elevadas, permitindo ampla adoção da biocatálise nas indústrias farmacêutica, química, de biocombustíveis e de alimentos.

A biocatálise está associada à fabricação de produtos químicos “verdes”, sustentáveis e de baixo custo. Em relação à quimiocatálise, os biocatalisadores oferecem vantagens inerentes para a síntese, incluindo:

• Diversidade significativa de compostos, de fontes naturais ou geneticamente projetadas para lidar com uma ampla linha de transformações químicas
• Especificidade das reações biocatalíticas que mitigam a necessidade de certas estratégias clássicas de síntese/processamento químico, como o uso de grupos de bloqueio/desbloqueio, separação de mistura enantiomérica e processamento para remover subprodutos indesejados
• Simplificação dos requisitos de infraestrutura e matéria-prima, pois muitos processos de biocatálise podem ser realizados em reações de vaso único e eliminar as etapas de reação exigidas pela catálise química tradicional  

As enzimas usadas na biocatálise têm habilidades importantes e frequentemente aproveitadas, que incluem:

A) Grupo funcional ou ligação específica do local e reconhecimento do alvo de outros produtos biológicos ou pequenas moléculas

B) Associação ou deslocamento promovido de outros produtos biológicos ou pequenas moléculas

C) Características estruturais ou eletrostáticas que facilitam o transporte de íons

D) Transformações estruturais ordenadas a desordenadas e, portanto, atividades catalíticas variadas

E) Modificações alostéricas ou indiretas que induzem ou suprimem a atividade enzimática

A pesquisa em biocatalisadores recombinantes aprimorados ou modificados continua a expandir sua utilidade em química severa, melhorar o escopo da reação, a robustez da enzima e a capacidade de reutilização. Biocatalisadores naturais e projetados estão agora disponíveis para realizar transformações químicas importantes, como a formação de ligações C-C, ligações amida, formação de aminas quirais e funcionalização C-H.

O escopo das enzimas usadas para biotransformações é extraordinariamente amplo e abrange praticamente todos os setores industriais, incluindo alimentos, farmacêutico, têxtil, biocombustível, papel, produtos químicos e artigos domésticos. Na síntese de produtos químicos finos, produtos farmacêuticos e intermediários relacionados, a biocatálise (ou seja, catálise enzimática ou catálise mediada por enzima) cresceu rapidamente como uma tecnologia capacitadora. As enzimas estão disponíveis para várias biotransformações, como oxidações, reduções, adições e eliminações. 

As seis classes principais de enzimas e exemplos de aplicação: 

1. Oxidorredutases que catalisam oxidações e reduções moleculares. As enzimas monooxigenase com oxigênio molecular permitem a formação da ligação C-O, e enzimas específicas foram projetadas para permitir oxidações de álcoois, cetonas, aldeídos e aminas. Com relação às reduções, as cetoredutases (KREDS) e as desidrogenases permitem a síntese de álcoois enantioespecíficos. Outras enzimas podem reduzir ligações como C=N, transformando nitrilas em aminas. 

2. As transferases são úteis para transferir grupos funcionais de uma molécula para outra. Quinase e fosfatases (adição e remoção de fosfatos) são especialmente importantes para cascatas de sinalização molecular, replicação de DNA, transcrição de RNA e outras funções. Existem também muitas transferases biologicamente significativas que desempenham funções, tais como, conversão de cetonas ou aldeídos em aminas e que podem fazê-lo estereosselectivamente.

3. As hidrolases catalisam a hidrólise de vários substratos. Nucleases ou proteases são prolíficas e essenciais na reciclagem de ácido nucléico e peptídeo. Hidrolases como lipase, protease e acilase agem como catalisadores para Michael 1,4-adições, amplamente utilizadas para formar ligações C-C e carbono-heteroátomo.

4. As liases geralmente catalisam reações por meio da formação ou eliminação de duplas ligações. Diferente de uma reação de substituição por hidrolases, reações de carboxilase ou descarboxilase são comuns em biocatálise farmacêutica para a adição ou remoção de CO₂, assim como C-N liases que podem ser usadas para gerar aminoácidos incluindo ácidos aspárticos substituídos e alaninas.

5. As isomerases permitem o rearranjo de átomos em uma molécula. Isomerases, tais como racemases, estereoquímica invertida no carbono quiral alvo e isomerases cis-trans catalisam a isomerização de isômeros cis-trans em alcenos ou cicloalcanos. A conversão de glicose em frutose via glicose isomerase representa uma importante biotransformação enzimática industrial.

6. As ligases formam novas ligações químicas ao juntar duas moléculas para formar uma molécula maior. Uma das aplicações mais importantes é o uso de ligase do DNA na formação de moléculas de DNA recombinante e são o complemento de endo- ou exonucleases.

Produção de catalisadores de enzimas. Geralmente, as enzimas naturais ou recombinantes para biocatálise são sintetizadas primeiro por meio de fermentações, na maioria das vezes utilizando bactérias, mas ocasionalmente também são derivadas de culturas de leveduras. Embora as enzimas possam ser produzidas em culturas de células de mamíferos mais complexas, bactérias e leveduras geralmente contêm vias moleculares suficientes e de ocorrência natural para atingir o dobramento e modificações pós-tradução moderadas necessárias para enzimas biocatalíticas recombinantes. As enzimas produzidas por meio de tais fermentações são geralmente colhidas por lise ou outra ruptura das estruturas celulares para liberar as enzimas recombinantes e são posteriormente purificadas em um processo semelhante a outros produtos farmacêuticos biológicos. A fermentação, a colheita e o processo de purificação apresentam seus próprios desafios, que são enfrentados com o aproveitamento da Tecnologia Analítica de Processos (PAT).

Estabilização e imobilização. A imobilização de enzimas é usada para alcançar enzimas mais estáveis, ativas e reutilizáveis. Geralmente, os agregados enzimáticos reticulados (CLEAs) podem ser formados com uma série de diferentes substratos sólidos, como sílica, resinas ou polímeros, como PEG e até mesmo outros complexos, como nanopartículas de lipídios (LNPs). Para algumas aplicações de química de fluxo, os CLEAs também podem ser formados em superfícies e sensores, como aqueles usados em medições aprimoradas de superfície para fins analíticos e catalíticos. Os desafios da síntese de componentes relacionados, adsorções, conjugações ou outras associações, bem como a estabilidade e formulação do produto, são abordados por soluções semelhantes para a formulação de vacinas e processos adjuvantes.

Captura e isolamento do produto. Após a biocatálise, os CLEAs são separados do produto e dos reagentes residuais e podem ser reciclados ou retidos de outra forma. Produtos de pequenas moléculas podem então ser isolados por meio de filtrações ou processos de cromatografia, embora muitos processos continuem a favorecer os métodos de cristalização. Os produtos de biocatálise de moléculas grandes geralmente continuariam com os fluxos de trabalho do processo de purificação tradicionais.

Compreender a meia-vida prática e a estabilidade de qualquer enzima livre, ligada ao substrato ou imobilizada na superfície pode ser fundamental para o projeto de protocolos de biocatálise adequados. As considerações incluem:

• Solventes — Muitas enzimas naturais lutam para lidar com as reações de solventes orgânicos. Um perfil em constante evolução de enzimas projetadas ou recombinantes está melhorando a compatibilidade com as condições de solvente orgânico. As enzimas recombinantes são agora capazes de catalisar reações em ambientes de solventes orgânicos, por exemplo, permitindo o uso de fosforamiditos modificados na síntese de oligonucleotídeos.
• pH — As enzimas geralmente operam melhor dentro de faixas estreitas de pH e toleram variação de pH <0,5 unidades de pH. Assim, o controle de pH é frequentemente um parâmetro crítico a ser considerado para muitas reações biocatalíticas e pode ser difícil ou tedioso de controlar manualmente. 
• Temperatura — Enzimas naturais e suas contrapartes recombinantes funcionam com eficiência em temperaturas específicas com intervalos bastante estreitos. Desvios de temperatura podem causar mudanças na cinética da reação, rendimento de produto ou outros resultados críticos do processo.
• Oxigênio Dissolvido — Este parâmetro crítico do processo, especialmente importante para reações de oxigenação e redução, é geralmente controlado por pulverização ou dosagem de headspace oxigênio ou gás inerte. Para garantir que as enzimas oxidorredutase possam operar com eficiência máxima, é fundamental otimizar a quantidade e a transferência de massa do oxigênio dissolvido (incluindo as características de bolha) na mistura de reação.
• Mistura, Dinâmica de Fluidos e Gases — O aparelho de mistura adequado pode ter um grande efeito no ciclo de vida das enzimas biocatalíticas, especialmente em execuções de longa duração, química de fluxo ou estilo de perfusão. O aumento de escala das reações biocatalíticas pode ser subótimo se a mistura não for suficientemente caracterizada. A mistura também é fundamental para a distribuição adequada do gás e a transferência de massa.
• Estequiometria de Reação — As razões corretas de reagentes para enzimas são fundamentais e podem ser determinadas por estudos de Design de Experimentos (DoE), automatizados por reatores químicos e auxiliados por PAT integrado no desenvolvimento do processo.

O desenvolvimento e o aumento de escala das reações biocatalíticas dependem da natureza dos biocatalisadores específicos usados, substratos, cofatores e condições de reação aplicadas. Como na catálise química, essa matriz complexa e interdependente de variáveis é melhor compreendida pelo controle cuidadoso das variáveis de reação quando combinadas com informações de medições analíticas em tempo real. No entanto, muito do desenvolvimento do processo, aumento de escala e limitações de densidade de dados para processos modernos estão ligados à orientação manual contínua das reações de biocatálise, que têm custos significativos de tempo e recursos. A operação manual implica na presença de pessoal no biorreator para manutenção, ajuste e amostragem quase constante, a fim de atender à crescente demanda regulatória e institucional de caracterização de processo e transferência de tecnologia.

A operação autônoma da biocatálise é possível por meio de plataformas de automação de laboratório que respondem às condições de reação dinâmica continuamente medidas por meio de sensores integrados e tecnologias analíticas de processo (PAT). Plataformas de reatores de síntese automatizados facilitam a experimentação mais rápida com minimização de erro humano ou intervenção. Emparelhado com amostragem de reator modular automatizado para análise cromatográfica off-line, todos os parâmetros de processo críticos (CPP) podem ser sobrepostos e tendidos. O controle de parâmetros e os dados analíticos do processo são registrados automaticamente em tempo real e estruturados para gerenciamento e arquivamento de dados. A redução da variabilidade experimental e o aumento da reprodutibilidade em diferentes escalas de reatores otimizam ainda mais o aumento de escala baseado em evidências.

• Os reatores automatizados EasyMax e OptiMax desempenham papéis importantes, garantindo que o efeito das variáveis-chave das biotransformações, como temperatura, pH, taxas de mistura e dosagem, sejam precisamente controlados, modelados e registrados com eficácia.
• As tecnologias espectroscópicas in-situ ReactIR e ReactRaman são úteis para rastrear e medir espécies-chave de reação em tempo real. O ReactIR rastreia os analitos principais em solução sem interferência de partículas suspensas, como células inteiras.
• O ParticleTrack com tecnologia FBRM mede o tamanho e a distribuição das partículas em suspensões heterogêneas. O EasyViewer captura imagens in situ de partículas e realiza análises de imagem em tempo real sobre turbidez, forma, dimensão, morfologia, contagem e distribuições do sistema.
• O EasySampler permite amostragem totalmente automatizada e autônoma de reações químicas, incluindo resfriamento e diluição de amostras na preparação para análise off-line.

O reator automatizado EasyMax é uma estação de trabalho completa para otimização de parâmetros em biocatálise para apoiar o desenvolvimento, aumento de escala e execução. Este sistema totalmente automatizado permite um controle preciso sobre os parâmetros do processo.

• Gerencie CPPs, incluindo identificação de material de origem, taxas de dosagem, temperatura, agitação, headspace, aspersão, medição de pH e titulação
• Integra-se prontamente com análise in-situ para biocatálise, incluindo ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (análise de imagem in-situ) e EasySampler (amostragem automatizada de reator in-situ)
• Faça experimentos sem supervisão; execute amostragem inteligente automatizada quando for necessária a análise off-line
• O Software iC permite a execução e o controle automatizados de todos os experimentos e equipamentos periféricos, bem como a coleta completa de dados e manutenção de registros

O ReactIR usa espectroscopia FTIR para medir componentes aquosos e orgânicos solúveis em estudos de biocatálise. As medições do ReactIR não são afetadas por sólidos em suspensão, bolhas ou outra massa particulada.

O ReactRaman usa espectroscopia Raman para fornecer análise molecular de partículas e análise de reação.

• Monitora vários atributos de qualidade do produto in situ e em tempo real em um recipiente ou fluxo de processos em andamento
• Elimina atrasos associados a amostras coletadas
• Quantifica o impacto das etapas de processamento no rendimento do produto e na eficiência do processo
• Fornece análises de dados acionável para tomadas de decisão e controle em tempo real
• Oferece suporte às diretrizes regulatórias ICH por meio de experimentação e digitalização rica em dados
• Auxilia no aumento de escala da P&D até a fabricação
• Mede concentrações de analito tão baixas quanto 500 ppm em volumes de alguns mililitros a milhares de litros

O ParticleTrack usa a tecnologia Medida de Reflectância por um Feixe de Luz Focalizado (FBRM) e é um instrumento baseado em sensor óptico que é inserido diretamente em um recipiente para rastrear a alteração do tamanho das partículas e a contagem em tempo real. O ParticleTrack usa medições de Distribuição de Comprimento de Corda (CLD) para obter a Distribuição do Tamanho de Partículas (PSD).

• Partículas e estruturas de partículas são monitoradas continuamente, conforme as condições experimentais ou parâmetros variam
• Caracterize a síntese de partículas em fase sólida, imobilização enzimática, clivagem e morfologias de processos relacionados
• Rastreie o lote ou o crescimento contínuo de produtos de biocatálise durante a biocatálise em tempo real, sem a necessidade de remoção de amostra
• Caracterize as condições do sistema de partículas que afetam a nucleação, precipitações, polimorfismo e outros atributos do sistema

O EasyViewer é um analisador de tamanho de partícula baseado em sensor que é inserido diretamente em um recipiente para capturar imagens do sistema de partículas. O EasyViewer realiza análise de imagem e mede a contagem de partículas, distribuição de tamanho e morfologia a partir de imagens em linha resolvidas no tempo do processo, permitindo que as populações tenham tendências ao longo do tempo.

• Partículas e estruturas de partículas são monitoradas continuamente, conforme as condições experimentais ou parâmetros variam
• Caracterize a síntese de partículas em fase sólida, imobilização enzimática, clivagem e morfologias de processos relacionados
• Meça a transferência de massa (K_La) através da caracterização da bolha
• Rastreie o lote ou o crescimento contínuo de produtos de biocatálise durante a cristalização em tempo real, sem a necessidade de remoção de amostra
• Caracterize as condições do sistema de partículas que afetam a nucleação, precipitações, polimorfismo e outros atributos do sistema

O ReactIR Fornece Informações sobre como Otimizar a Síntese do Ester

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147

No desenvolvimento de moléculas complexas, os químicos procuram maneiras de simplificar as sínteses de várias etapas. O uso de enzimas tanto como catalisadores quanto na resolução de compostos racêmicos está bem estabelecido. As técnicas analíticas in situ são complementares e altamente úteis para auxiliar na otimização das transformações químicas e bioquímicas nas etapas de síntese individuais.

Neste trabalho, os pesquisadores estiveram envolvidos no desenvolvimento de uma síntese multiquilograma para o placarbil de arbaclofen, usado para transtornos de abuso de álcool. Uma etapa envolveu a síntese de um composto intermediário de éster de succinato chave e a resolução subsequente do éster em um único (S)-enantiômero. Para obter este único enantiômero em quantidades suficientes, eles exploraram duas abordagens diferentes, cromatografia quiral preparativa e resolução enzimática. A última abordagem foi considerada vantajosa, e eles descobriram que a lipase C. antartica A imobilizada em polimetacrilato (IMMCALA-T2-150 lipase) forneceu a via viável para o intermediário de éster succinato resolvido.

Para sintetizar inicialmente o éster succinato, eles descobriram que o composto tiocarbonato análogo reagiu com cloreto de sulfurila, para produzir o éster desejado. Para otimizar o rendimento do éster e minimizar um subproduto, o ReactIR foi empregado. O FTIR in situ mostrou que quando o composto tiocarbonato e o cloreto de sulfuril reagiram, formou-se um composto cloroformato intermediário que tinha estabilidade térmica limitada. Assim que este intermediário se formou e antes da decomposição, foi adicionada N-hidroxissuccinimida, seguida pela adição de trietilamina. A adição de trietilamina foi altamente exotérmica e levou à transformação do intermediário cloroformato no éster succinato desejado.

O ReactIR Rastreia Concentração de Bicarbonato Chave

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

Os autores descobriram que as enzimas de ácido di-hidroxibenzoico (des)carboxilases catalisam a orto-(des)carboxilação regio-seletiva reversível de fenólicos e são de interesse significativo, uma vez que realizam carboxilações em temperaturas e pressões muito mais baixas do que respectivos quimocatalisadores. Neste trabalho atual, eles relatam que o ácido 2,3-dihidroxibenzoico (des)carboxilase de Aspergillus oryzae atua como um catalisador para permitir a orto-carboxilação de moléculas fenólicas, e isso está associado à transformação moderada de amina simultânea do co-substrato CO₂ em bicarbonato in situ.

Os autores afirmam que a natureza do co-substrato CO₂, ou a forma hidratada do bicarbonato, é importante nas carboxilações enzimáticas, uma vez que o mecanismo de ligação e ativação do substrato determina o agente de carboxilação real. Em seu trabalho, um ReactIR equipado com um sensor de inserção ATR de diamante foi usado para rastrear a formação de bicarbonato. Como resultado deste trabalho, eles relatam o desenvolvimento de condições de reação que melhoram significativamente a conversão e a taxa de reação para a carboxilação biocatalítica do catecol.

O ReactIR Investiga Acoplamento Oxidativo com Vários Substratos e Ajuda na Otimização das Condições de Reação

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Bioquímica de Processo, 50(10), 1591–1599.

Os autores relatam a investigação do uso da lacase enzimática fúngica (Novozym 51003) para o acoplamento C-C oxidativo em compostos fenólicos. A lacase demonstrou aplicabilidade para oxidar fenóis, anilinas, etc. em quinonas com redução de O₂ em água. O acoplamento de lacase é normalmente considerado não seletivo e, portanto, os autores iniciaram um estudo da oxidação da lacase em vários substratos fenólicos para determinar a eficácia/seletividade do acoplamento C-C. Eles determinaram que as dimerizações oxidativas de fenóis 2,6 dissubstituídos eram não apenas altamente seletivas, mas também capazes de ser significativamente aumentadas. Eles demonstraram que o produto oxidativo 2,6 diisopropil fenol resultante foi facilmente reduzido ao composto de bifenol análogo.

Neste estudo, os pesquisadores inicialmente selecionaram substratos alvo por meio de medição de oxigênio durante as oxidações iniciadas pela lacase. Eles então usaram o ReactIR (Espectroscopia FTIR in situ) para investigar a eficácia e seletividade da reação de acoplamento iniciada pela lacase com os substratos fenólicos específicos e para definir as condições ideais para maximizar o produto. Estudos de FTIR in situ demonstraram que a síntese regiosseletiva simétrica de diquinona ocorreu de forma bastante rápida. Além disso, o FTIR in situ permitiu o monitoramento de polimerizações que ocorreram por meio das oxidações de lacase e, uma vez que o método FTIR-ATR rastreia apenas analitos de soluto, os precipitados poliméricos não interferiram na medição.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., “Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19”, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
• Gan, J., Peng, Y., Chen, Q., Hu, G., Xu, Q., Jin, L., & Xie, H. (2020). Reversible covalent chemistry of carbon dioxide unlocks the recalcitrance of cellulose for its enzymatic saccharification. Bioresource Technology, 295, 122230. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.122230
• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., … Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science, 366(6470), 1255–1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
• Nguyen, T. C., Anne-Archard, D., Cameleyre, X., Lombard, E., To, K. A., & Fillaudeau, L. (2019). Bio-catalytic hydrolysis of paper pulp using in- and ex-situ multi-physical approaches: Focus on semidilute conditions to progress towards concentrated suspensions. Biomass and Bioenergy, 122, 28–36. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.01.006
• Thompson, M. P., Peñafiel, I., Cosgrove, S. C., & Turner, N. J. (2018). Biocatalysis Using Immobilized Enzymes in Continuous Flow for the Synthesis of Fine Chemicals. Organic Process Research & Development, 23(1), 9–18. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.8b00305
• Hugentobler, K. G., Rasparini, M., Thompson, L. A., Jolley, K. E., Blacker, A. J., & Turner, N. J. (2017). Comparison of a Batch and Flow Approach for the Lipase-Catalyzed Resolution of a Cyclopropanecarboxylate Ester, A Key Building Block for the Synthesis of Ticagrelor. Organic Process Research & Development, 21(2), 195–199. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.6b00346
• Pečar, D. e Goršek, A. (2017). Process and kinetic characteristics of glucose oxidation catalyzed with immobilized enzyme. Reaction Kinetics, Mechanisms and Catalysis, 122(1), 43–51. https://doi.org/10.1007/s11144-017-1202-2
• Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332. https://doi.org/10.1002/biot.201700332
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