تخليق قليل النوكليوتيدات

قليل النوكليوتيدات ، أو oligos ، عبارة عن أجزاء قصيرة مفردة أو مزدوجة الشريطة من الأحماض النووية مرتبطة ببعضها البعض لتشكيل بوليمرات بيولوجية أحادية السلسلة. يمكن اعتبار قواعد النيوكليوتيدات الفردية مكافئة للمونومرات التي تشكل البوليمرات الكيميائية الكلاسيكية. يتكون النيوكليوتيدات من ثلاثة أجزاء: قاعدة تحتوي على النيتروجين ، وجزيء سكر يحتوي على خمسة كربون (هذان الجزءان هما النيوكليوزيد) ، ومجموعة فوسفاتية واحدة أو أكثر. بدلا من ذلك ، يمكن أن تتكون النيوكليوتيدات من قواعد غير طبيعية أو غير قانونية. تشمل الأمثلة الشائعة LNA (الأحماض النووية المقفلة) ، Morpholino ، والقواعد المعدلة هيكليا أو العمود الفقري. 

يشكل الارتباط المعقد للنيوكليوتيدات الجزيئات الحيوية للحمض النووي الريبي والحمض النووي الحرجة بيولوجيا. في حالة الحمض النووي الريبي ، وهو بوليمر حيوي أحادي الخيط ، يكون السكر عبارة عن ريبوز. في الحمض النووي ، يحتوي جزيء الخيط المزدوج على سكر الديوكسيريبوز. إن التسلسلات القصيرة للأحماض النووية منقوص الأكسجين والأحماض النووية الريبية هي اللبنات الأساسية لقليل النوكليوتيدات المهمة. تخلق الروابط المحددة لهذه النيوكليوتيدات الجزيئات الحيوية المستهدفة المستخدمة في التطبيقات البيولوجية والطبية والطب الشرعي والسريري. 

يمكن تشكيل قليل النوكليوتيدات إما إنزيميا من خلال انقسام الجزيئات الحيوية الأكبر أو من خلال التخليق الكيميائي المستهدف. في الحالة الأخيرة ، تخليق النوكليوتيدات العضوية هو العملية الكيميائية التي يتم من خلالها تصنيع فوسفوراميديت النيوكليوزيد - وهو عنصر أحادي رئيسي من قليل النوكليوتيدات. فوسفوراميديت النيوكليوزيد (المعروف أيضا باسم النيوكليوسيدات أو الأميديتات) هي نفسها مشتقات من النيوكليوسيدات الطبيعية أو الاصطناعية.

وبالتالي ، فإن النيوكليوتيدات عبارة عن جزيئات مركبة تتكون من نيوكليوزيد مرتبط تساهميا ومجموعة فوسفات. ترتبط النيوكليوتيدات في تسلسل معين لتشكيل المنتج المطلوب. وبالتالي ، تتكون قليل النوكليوتيدات من أجزاء قصيرة من الأحماض النووية المرتبطة ببعضها البعض لتشكيل بوليمرات بيولوجية أحادية السلسلة ("-mers"). نظرا لأن معظم قليل النوكليوتيدات (oligos) تتكون عادة من ما يصل إلى 20 نيوكليوتيدات مرتبطة (على الرغم من إمكانية المزيد) ، يمكن اعتبارها جزيئات صيدلانية حيوية صغيرة. 

مثل الكثير من الجزيئات الصغيرة الأخرى ذات الصلة بالصيدلانية ، يتطلب تخليق قليل النوكليوتيدات تحكما دقيقا فيما يتعلق بدرجة الحرارة ودرجة الحموضة وجودة الركائز وما إلى ذلك. بسبب الطرق النموذجية المستخدمة في تخليق قليل النوكليوتيدات ، كلما كان تسلسل النيوكليوتيدات أطول وأكثر تعقيدا ، زادت صعوبة تحقيق أهداف العائد والنقاء والتكلفة. تعد التقنيات التحليلية للعمليات (PATs) مفيدة في تحقيق هذه الأهداف.

أوليغونوكليوتيد الاشعال والمجسات

الاستخدام الأكثر شيوعا لقليل النوكليوتيدات الاصطناعية هو مجسات وبادئات قصيرة نسبيا (تصل إلى 30 مر) في مجموعة متنوعة من التطبيقات. يتضمن ذلك توليف تسلسل النيوكليوتيدات المقترن أو "المكمال" بخيط أكبر من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف (التسلسل المستهدف). كبادئات ، تستخدم oligos عادة لبدء تفاعلات إنزيمية على سبيل المثال إنشاء ملايين إلى مليارات النسخ من تسلسل مستهدف قصير أو طويل. ومن الأمثلة المعروفة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو طريقة تسلسل سانجر. تشمل تطبيقات أوليغو أوليغو تسلسل الحمض النووي والتعبير الجيني والاستنساخ والتشخيص الجزيئي.

كمجسات ، تعمل oligos على تحديد تسلسل هدف محدد للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وربطه من أجل تأكيد وجود هذا التسلسل في مادة معينة. تشمل التطبيقات التي تستخدم مجسات oligo إجراءات النشاف مثل النشاف الشمالي (للحمض النووي الريبي) أو النشاف الجنوبي (للحمض النووي) ، كتسلسلات مترافقة بالفلوروفور في المصفوفات الدقيقة التي تكتشف التغيرات في التعبير عن الجينات أو تستخدم في فحص الأمراض الوراثية أو لتحديد مسببات الأمراض المحددة (التشخيص الجزيئي).

Oligo Therapeutics / العلاج الجيني

في التطبيقات العلاجية ، تستفيد قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (ASO) ، بشكل عام من 20 إلى 30 نوعا ، من البيولوجيا الطبيعية وتسهل تثبيط الجينات أو إسكات الجينات (تدمير) تسلسل الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيه أو النشط بشكل مفرط ، وهذا بدوره يمنع التعبير عن بعض البروتينات التالفة أو المفرطة النشاط التي قد تسبب المرض أو تسهله. تكثفت الأبحاث حول العلاجات القائمة على قليل النوكليوتيدات بشكل كبير وتم الموافقة على العديد من الأدوية في السنوات الأخيرة.

الاستخدام المستقبلي للنيوكليوتيدات الاصطناعية: استكشاف طرائق لقاح الحمض النووي والحمض النووي الريبي

على الرغم من أنها ليست قليل النوكليوتيدات بحكم التعريف الصارم ، إلا أن منتجات اللقاح القائمة على الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي ، مثل الرنا المرسال أو البلازميد أو الأحماض النووية القائمة على النواقل ، التي يبلغ طولها مئات أو آلاف القواعد ، تمثل الخطوط الأمامية لتقنيات النوكليوتيدات الاصطناعية المتطورة.

من الناحية المفاهيمية ، فإن لقاحات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ستستغني عن جميع الأجزاء غير الضرورية أو الضارة من البكتيريا أو الفيروس المسببة للأمراض. بدلا من ذلك ، سيحتوي هذا اللقاح القائم على الحمض النووي على رمز لأجزاء قليلة فقط من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي للممرض. توجه خيوط الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي جسم المريض لإنتاج مستضدات فردية أو شظايا من العامل الممرض ، ثم تعزيز الاستجابة المناعية للمستضد. من خلال الحوسبة الحديثة ونمذجة السيليكو ، يمكن إنشاء طرائق لقاح قليل النوكليوتيدات هذه في غضون أيام أو أسابيع مع إعطاء تسلسل مستهدف مناسب للتصميم عليه. كتقنية أساسية ، تعتمد اللقاحات القائمة على الحمض النووي على مجموعات قياسية من اللبنات الأساسية أو المواد الخام التي تتيح عددا لا يحصى من التوليفات حسب الرغبة تقريبا. على هذا النحو ، فهي أيضا رخيصة نسبيا وسهلة الإنتاج مقارنة بطرق اللقاح التقليدية. ومع ذلك ، لا يزال هذا نموذجا ناضجا لصناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية ويتم التصدي باستمرار لتحديات جديدة ، بعضها فريد من نوعه لمنتجات oligo والحمض النووي الطويل والبعض الآخر مشترك مع طرق العلاج الحيوي الأخرى.

تخليق قليل النوكليوتيدات هو العملية الكيميائية التي يتم من خلالها ربط النيوكليوتيدات على وجه التحديد لتشكيل المنتج المتسلسل المطلوب. يشيع استخدام تخليق الطور الصلب المستمر باستخدام عمود سرير معبأ لإنتاج قليل النوكليوتيدات. في بعض الحالات ، يتم استخدام تفاعل الطين.

تستغرق عملية إنتاج تسلسل أوليغومر الهدف عددا من الدورات التي تتكون من خطوات تركيبية محددة. في الخطوة الأولى ، تتم إزالة مجموعة حماية ثنائي ميثوكسي تريتيل 4،4 على النيوكليوتيدات المدعومة بالمرحلة الصلبة. بعد ذلك ، يتم تنشيط مونومر الفوسفوروميديت ويقترن بسرعة من خلال مجموعة الهيدروكسيل الحرة على النيوكليوتيدات المرتبطة بالمرحلة الصلبة لإنشاء ثنائي النوكليوزيد الذي يحتوي على وصلة ثلاثية الفوسفيت. في الخطوة الثالثة ، يتأكسد تريستر الفوسفيت. في الخطوة الأخيرة (من الدورة الأولى) ، يتم "تغطية" أي نيوكليوسيدات مدعومة غير متفاعلة عن طريق الأستلة لمنع تكون المنتجات الجانبية غير المرغوب فيها في الدورة التالية.

يتم تحديد طول قليل النوكليوتيد من خلال عدد النيوكليوتيدات التي يتكون منها التسلسل. فيما يتعلق بالتسمية، يتم تعريف التسلسل الذي يبلغ طوله 20 نيوكليوتيد على أنه "20-mer". طول oligo أمر بالغ الأهمية للتطبيقات المختلفة. على سبيل المثال ، يتم استخدام oligos قصيرة المر بشكل شائع في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بينما تستخدم التسلسلات الطويلة جدا (200 قاعدة أو أكثر) في التطبيقات الصعبة مثل الاستنساخ أو تحرير كريسبر. يعد تخليق oligos المتخصصة طويلة العمر أمرا صعبا ويتطلب تقديم تسلسل نقي كلا من طرق التحكم الفعال في التوليف والتنقية. في المتوسط ، يبلغ طول معظم oligos أقل من 60 مر. نظرا لأن الطريقة التي يتم بها تصنيع oligos تتطلب دورات تفاعل متكررة تضيف نيوكليوتيدات إضافية ، فكلما طالت مدة التسلسل المطلوب ، زادت احتمالية تكوين منتجات ثانوية غير مرغوب فيها - والتي قد تشمل تسلسلات الحذف أو الاقتطاع.

يتم استخدام طرق تنقية مختلفة اعتمادا على أهداف الجودة والكمية والتكلفة. على سبيل المثال ، تمت إزالة المنتجات الثانوية الخالية من الملح من التخليق الكيميائي ، ولكن لا تزال حالات فشل التسلسل. هذه oligos المحلاة مفيدة من منظور التكلفة والفعالية للتطبيقات الأكثر روتينية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالنسبة للتطبيقات الأكثر تطلبا ، يزيل كروماتوغرافيا الطور العكسي التسلسلات غير المرغوب فيها من المنتج ، ولكن ليس بنفس فعالية الرحلان الكهربائي للهلام ، الذي يوفر منتجا تسلسليا عالي النقاء ، ولكن عادة بكميات محدودة. خاصة بالنسبة للمخاوف السريرية ، يعد الاحتفاظ بالعائد مصدر قلق دائم في جميع أنحاء التوليف والمعالجة النهائية أيضا.

عادة ما يتضمن التخليق الكيميائي الكلاسيكي للطور الصلب استخدام البوليمر أو الخرز الزجاجي المتخصص الذي لا يتأثر بظروف التفاعل. يمكن احتواء هذه الخرزات في أعمدة تتدفق فيها المواد المتفاعلة والكواشف والمذيبات. الغرض من الخرزات هو العمل كمنصة ترتبط عليها جزيئات الركيزة تساهميا ، ثم تعمل على أساسها عن طريق التفاعل الكيميائي. تعد الحماية وإزالة الحماية لبعض المجموعات الوظيفية على جزيء الركيزة أمرا أساسيا للتخليق ولضمان الحصول على المنتج المطلوب. تتم إزالة منتج التخليق عن طريق كسر الرابطة بينه وبين حبة البوليمر الأساسية كيميائيا.

يعتبر تخليق الطور الصلب فعالا في إنتاج المنتج المنقى بسرعة ، حيث يتم غسل الشوائب والمواد غير المتفاعلة في خطوات التوليف المختلفة. علاوة على ذلك ، فإن التوليف بأكمله قابل للتحكم في الكمبيوتر والأتمتة. تخليق الطور الصلب هو الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لإنتاج الببتيد والنوكليوتيدات المخصصة. في الحالة الأخيرة ، يلزم إجراء العديد من الدورات المتكررة لإضافة النيوكليوتيدات بالتتابع من أجل تشكيل التسلسل المستهدف.

يمثل تخليق قليل النوكليوتيدات في المرحلة الصلبة العديد من التحديات ، بما في ذلك انخفاض المحصول مع زيادة طول السلسلة. غالبا ما يفترض أن العائق الفراغي هو آلية لضعف الغلة حيث قد يتداخل واحد أو أكثر من الخيوط الثابتة على السطح مع كل استطالة متتالية لجارها.

لمواجهة هذه التحديات وغيرها ، هناك طرق مختلفة لتخليق قليل النوكليوتيدات في الطور السائل.

العديد من الخطوات الأساسية لتخليق الطور السائل مماثلة لتخليق الطور الصلب. الفرق الرئيسي هو أن التوليف يحدث في المحلول أو الطور السائل (أي غير مثبت على أي سطح). نظرا لأن هذه العملية لا تزال مستمرة في دورات ، فهناك العديد من الطرق المصاحبة لإزالة الكواشف غير المتفاعلة مع الاحتفاظ بمنتج قليل النوكليوتيدات الممدود.

تم إنشاء تقنية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتخليق قليل النوكليوتيدات في عام 1985. في عام 1986 ، تم تقديم أول استخدام لإنزيم Taq polymerase . ومع ذلك ، فقد كافح تخليق قليل النوكليوتيدات الصناعي لاعتماد تخليق قليل النوكليوتيدات الأنزيمي لثلاثة أسباب رئيسية:

1. يتطلب التخليق الأنزيمي نموذجا يمكن أن يعمل عليه إنزيم بوليميراز الحمض النووي الممتد للتسلسل. على هذا النحو ، لا يمكن أن يعمل تخليق قليل النوكليوتيدات بواسطة الإنزيم بدون قالب. 
   
2. العديد من بادئات oligo أو المجسات أو أهداف ASO التي يمكن استخدامها كقالب هي نفسها أقصر من أن تصدر بشكل فعال وتحفيز تخليق البوليميراز.
   
3. يتم تعديل العديد من oligos العلاجية الاصطناعية كيميائيا لتسهيل عمر النصف المطول وتحسين الوظائف في الدورة الدموية الخلطية ، وهي التعديلات التي تحظر تفاعلها تقريبا أو كليا مع البوليميرات المشتقة تطوريا (وهذا يتعلق في الغالب بأنواع oligo الأطول مثل mRNA).

يستمر البحث والتطوير لبوليميراز  هندسي قادر على تخليق ASO باستخدام مخزونات النيوكليوتيدات المعدلة كيميائيا

يمكن أن تستفيد الطبيعة المعقدة لتخليق قليل النوكليوتيدات من درجة أعلى من مراقبة العملية ، وفهم آليات التفاعل والانحرافات ، والضوابط القابلة للتنفيذ. يمكن أن تقلل التحليلات في الوقت الفعلي باستخدام PAT أو تلغي الحاجة إلى التحليلات غير المتصلة بالإنترنت التي تستغرق وقتا طويلا أو بطيئة.

• يمكن استخدام ReactIR و ReactRaman لمتابعة حركية تفاعلات تخليق قليل النوكليوتيدات والمقارنات بين الأشواط.
• يسهل التحكم الدقيق في درجة الحرارة والتحريك والجرعات مع مفاعلات التخليق الكيميائي الآلي EasyMax جنبا إلى جنب مع تكامل اتجاهات وآليات التفاعل التقاط البيانات وسهولة إدارتها من خلال برنامج iC 

تم إثبات قدرات المراقبة في الوقت الفعلي للتحليل الطيفي FTIR في الموقعوالتحليل الطيفي رامان للكيمياء التي يتم إجراؤها في ظل ظروف التدفق ، وهي قابلة للتطبيق في الخطوات الرئيسية لتخليق قليل النوكليوتيدات.

• تخليق الفوسفوراميديت المعدل ومونومرات النيوكليوتيدات الطبيعية لضمان الهيكل والنقاء
• التخفيف من المخاطر الناجمة عن المشكلات الميكانيكية للمركب أو تغذية المحلول غير الصحيحة
• تتبع تفاعل اقتران مونومر الفوسفوروأميديت إلى مجموعة الهيدروكسيل الحرة على النيوكليوتيدات المرتبطة بالمرحلة الصلبة
• تتبع تمسخ وتلدين قليل النوكليوتيدات التكميلية في تخليق الخيط المزدوج.
• تحديد حركية التفاعل الكيميائي في عملية التلدين - تحديد وتتبع المواد الوسيطة أو المجهولة
• ربط التغييرات في الأطياف بالنقاط الرئيسية قيد المعالجة
• ينطبق على SPS ، تخليق الببتيد الدفعي والمتقارب (SPS + مرحلة الحل)

تعد بيئة التوليف التي يتم التحكم فيها جيدا أمرا حيويا لضمان نتيجة رد الفعل. توفر منصات المفاعلات الآلية الثقة والاتساق عبر جميع معلمات العملية الحرجة في وقت واحد.

• البيئة القابلة للتكرار أمر أساسي للعلم الجيد
• فهم تأثير معلمات العملية على سمات الجودة الهامة من خلال الجمع بين البيانات من أجهزة الاستشعار و PAT المضمنة
• يخفف البروتوكول والأتمتة من المخاطر اليدوية أو عدم الاتساق
• تسهيل البيانات القابلة للبحث والمنظمة
• اعتمد على عقود من الاستشهاد والأدلة لتوسيع نطاقها
• ينطبق على SPS ، تخليق الببتيد الدفعي والمتقارب (SPS + مرحلة الحل)