Síntese de Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos podem ser formados enzimaticamente por meio de clivagem de biomoléculas maiores ou por meio de síntese química orientada. Neste caso, a síntese de organonucleotídeos é o processo químico por meio do qual fosforamiditas de nucleosídeo — um elemento-chave monomérico de oligonucleotídeos — são sintetizadas. As próprias fosforamiditas de nucleosídeos (também conhecidas como nucleosídeos ou amidetos) são derivadas de nucleosídeos naturais ou sintéticos.

Portanto, os nucleotídeos são compostos por moléculas que consistem em um nucleosídeo ligado covalentemente e um grupo de fosfatos. Os nucleotídeos são ligados em uma sequência específica para formar o produto desejado. Deste modo, os oligonucleotídeos consistem em curtos segmentos de ácidos nucleicos que são ligados entre si formando polímeros (“-meros”) biológicos de cadeia única. Uma vez que a maioria dos oligonucleotídeos (ou oligos de forma abreviada) consiste tipicamente em até 20 nucleotídeos ligados (embora mais sejam possíveis), eles podem ser pensados como pequenas moléculas biofarmacêuticas. 

Assim como muitas outras pequenas moléculas farmacêuticas relevantes, a síntese de oligonucleotídeos requer controle cuidadoso com respeito a temperatura, pH, qualidade de substratos etc. Devido aos métodos típicos usados na síntese de oligonucleotídeos, quanto mais longa e complicada for a sequência de nucleotídeos, mais difícil será atingir os objetivos de rendimento, pureza e custo. Tecnologias Analíticas de Processo (TAPs) são úteis para atingir essas metas.

Oligonucleotídeos, ou oligos, são segmentos curtos de filamentos simples ou duplos de ácidos nucleicos que são ligados entre si para formar polímeros biológicos de cadeia simples. Os pares de bases de nucleotídeos individuais podem ser considerados como equivalentes aos monômeros que compõem os polímeros químicos clássicos. Um nucleotídeo consiste em três partes: uma base contendo nitrogênio, uma molécula de açúcar com 5 carbonos (essas duas partes são o nucleosídeo), e um ou mais grupos de fosfato. Por outro lado, nucleotídeos podem consistir em bases não naturais ou não canônicas. Exemplos comuns incluem LNA (ácidos nucleicos bloqueados), morfolina e bases estruturalmente modificadas ou pilares. 

A ligação complexa de nucleotídeos forma biomoléculas de DNA e RNA biologicamente cruciais. No caso de RNA, que é um biopolímero de filamento único, o açúcar é ribose. No DNA, a molécula de filamento duplo contém desoxirribose de açúcar. São as sequências curtas de ácidos desoxirribonucleicos e ácidos ribonucleicos que constituem os blocos de construção de importantes oligonucleotídeos. Ligações específicas desses nucleotídeos criam biomoléculas-alvo que são usadas em aplicações biológicas, médicas, forenses e clínicas. 

Sensores e Primers de Oligonucleotídeos

O uso mais comum de oligonucleotídeos sintéticos é como sensores e primers relativamente curtos (até 30 -meros) em uma ampla variedade de aplicações. Isso inclui sintetizar uma sequência de nucleotídeos que é emparelhada ou “complementar inversa” a um filamento-alvo de DNA ou RNA maior (sequência-alvo). Como primers, os oligos são normalmente usados para iniciar reações de enzima para, por exemplo, criar milhões ou bilhões de cópias de uma sequência-alvo curta ou longa. Exemplos bem conhecidos são a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou o método de sequência de Sanger. As aplicações de primers de oligo incluem sequenciamento de DNA, expressão gênica, clonagem e diagnóstico molecular.

Como sensores, os oligos permitem identificar e vincular uma sequência-alvo de DNA ou RNA específica a fim de confirmar a presença desta sequência em um determinado material. As aplicações que utilizam sensores de oligo incluem procedimentos de “Blotting”, tais como “northern blotting” (técnica para estudar a expressão gênica) (para RNA) ou “southern blotting” (técnica para confirmar a presença de uma sequência de DNA específica) (para DNA), como sequências conjugadas com fluoróforo em microarranjos que detectam mudanças na expressão gênica ou usadas na triagem de doenças genéticas ou para identificar patógenos específicos (diagnósticos moleculares).

Terapêuticas de Oligo/Terapia Genética

Nas aplicações terapêuticas, os oligonucleotídeos antissenso (ASO), geralmente espécies de 20 a 30 -meros, usufruem da biologia natural e facilitam a inibição ou o silenciamento genético (destruição) de sequências de RNA indesejadas ou hiperativas; isso, por sua vez, bloqueia a expressão de certas proteínas danificadas ou hiperativas que podem estar causando ou facilitando a doença. A pesquisa em terapias baseadas em oligonucleotídeos intensificou-se muito e vários medicamentos foram aprovados nos últimos anos.

Uso Futuro de Nucleotídeos Sintéticos: Explorando Modalidades de Vacina de DNA e RNA

Embora não sejam um oligonucleotídeo por definição estrita, os produtos de vacina com base em DNA ou RNA, tais como mRNA ou plasmídeo ou ácidos nucleicos com base em vetores, de muitas centenas ou milhares de bases de comprimento, representam a linha de frente das tecnologias de nucleotídeos sintéticos em evolução.

Em conceito, as vacinas de DNA ou RNA dispensariam todas as partes desnecessárias ou prejudiciais de uma bactéria ou vírus patogênico. Em vez disso, tal vacina baseada em ácido nucleico conteria somente código para algumas partes do DNA ou RNA do patógeno. Esses filamentos de DNA ou RNA instruiriam o sistema imunológico do paciente a produzir antígenos individuais ou fragmentos do patógeno. Com computação moderna e modelagem em silício, essas modalidades de vacinas de oligonucleotídeos podem ser criadas em questão de dias ou semanas, com base em uma sequência de destino apropriada para projetar. Como uma tecnologia de plataforma, as vacinas baseadas em ácido nucleico dependem de conjuntos-padrão de blocos de construção ou matérias-primas, que permitem uma miríade de combinações praticamente arbitrária. Como tais, também são relativamente baratas e fáceis de produzir comparadas às modalidades de vacinas tradicionais. Entretanto, este ainda é um paradigma em maturação para a indústria biofarmacêutica e novos desafios são constantemente enfrentados, alguns exclusivos dos produtos de oligo e ácido nucleico longo e alguns compartilhados com outras modalidades bioterapêuticas.

A síntese de oligonucleotídeos é o processo químico por meio do qual os nucleotídeos são ligados especificamente para formar o produto sequencial desejado. A síntese de fase sólida contínua usando uma coluna preenchida é normalmente usada para a produção de oligonucleotídeos. Em alguns casos, é utilizada uma reação de pasta em lote.

O processo de produção da sequência-alvo de oligômero demora vários ciclos que consistem em etapas sintéticas específicas. Na primeira etapa, um grupo protetor de dimetoxitritil 4,4’ no nucleotídeo suportado em fase sólida é removido. Em seguida, um monômero de fosforamiditas é ativado e rapidamente acoplado por meio do grupo hidroxila livre no nucleotídeo ligado à fase sólida para criar um dinucleosídeo que contenha uma ligação fosfito triéster. Na terceira etapa, o fosfito triéster é oxidado. Na etapa final (do primeiro ciclo), quaisquer nucleosídeos suportados que não reagiram são “protegidos” por meio de acetilação para evitar a formação de produtos colaterais indesejados no próximo ciclo.

O comprimento de um oligonucleotídeo é definido pelo número de nucleotídeos que compõem a sequência. Quanto à nomenclatura, uma sequência de 20 nucleotídeos longos é definida como “vinte-meros”. O comprimento de oligo é fundamental para as diferentes aplicações. Por exemplo, oligômeros curtos geralmente são usados em PCR, enquanto sequências muito longas (200 bases ou mais) são usadas em aplicações exigentes, como clonagem ou edição CRISPR. A síntese de oligômeros longos especializados é desafiadora e a distribuição de uma sequência pura requer controle de síntese eficaz e métodos de purificação. Em média, a maioria dos oligos é menor que 60 -meros em comprimento. Uma vez que a forma como os oligos são sintetizados requer ciclos de reação repetitivos que acrescentam nucleotídeos adicionais, quanto mais longa for a sequência necessária, maior será a probabilidade de formação de subprodutos indesejados — que pode incluir sequências de deleção ou encurtamento.

Diferentes métodos de purificação são usados dependendo dos objetivos de qualidade, quantidade e custo. Por exemplo, oligos sem sal têm subprodutos da síntese química removidos, mas as falhas de sequência permanecem. Esses oligos dessalgados são úteis do ponto de vista de custo e eficácia para aplicações mais rotineiras, como PCR.  Para aplicações mais exigentes, a cromatografia de fase reversa remove as sequências indesejadas de um produto, mas não é tão eficaz quanto à eletroforese em gel, que oferece um produto em sequência altamente purificado, mas tipicamente em quantidades limitadas. Especialmente para questões clínicas, a retenção de rendimento é também uma preocupação constante em todo o processamento de síntese e jusante.

A síntese química de fase sólida clássica envolve tipicamente o uso de polímeros ou contas de vidro especializadas que não são afetados pelas condições de reação. Essas contas podem estar contidas em colunas por meio das quais reagentes e solventes fluem. O objetivo dessas contas é agir como uma plataforma na qual moléculas de substrato são ligadas covalentemente e, em seguida, são influenciadas por reação química. Proteção e desproteção de certos grupos funcionais na molécula de substrato são a chave para a síntese e garantem a obtenção do produto desejado. O produto de síntese é removido quebrando quimicamente a ligação entre ele e a conta de polímero subjacente. 

A síntese de fase sólida é eficaz em produzir rapidamente produto purificado, uma vez que impurezas e materiais não reagentes são lavados em várias etapas da síntese. Além disso, toda a síntese é passível de controle de computador e automação.  A síntese de fase sólida é o método mais comum empregado para a produção de peptídeo e oligonucleotídeo customizados. Neste caso, são necessários inúmeros ciclos repetitivos para adicionar de forma sequencial os nucleotídeos a fim de formar a sequência-alvo. 

A síntese de oligonucleotídeos de fase sólida apresenta muitos desafios, incluindo a diminuição do rendimento conforme o comprimento da cadeia aumenta. O impedimento estérico é frequentemente considerado como um mecanismo de baixo rendimento em que um ou mais filamentos fixados à superfície podem interferir em cada prolongamento sucessivo de seu vizinho. 

Para atender a esses e outros desafios, há vários métodos de síntese de oligonucleotídeos de fase líquida. 

Muitas etapas básicas de síntese de fase líquida são análogas à síntese de fase sólida. A principal diferença é que a síntese ocorre em solução ou fase líquida (isto é, NÃO é fixada a qualquer superfície). Como esse processo ainda se desenvolve em ciclos, há vários métodos de acompanhamento para a remoção de reagentes que não reagiram, enquanto retêm o produto oligonucleotídeo alongado.

A técnica de usar PCR para síntese de oligonucleotídeos foi estabelecida em 1985. Em 1986, foi introduzido o primeiro uso da enzima Taq polimerase. Ainda, a síntese de oligonucleotídeos industrial tem batalhado para adotar a síntese enzimática de oligonucleotídeos por três razões principais:

1. A síntese enzimática requer um modelo no qual a enzima de polimerase de sequenciamento de DNA ampliado possa operar. Como tal, a síntese de oligonucleotídeos de novo por enzima não pode operar sem um modelo. 
   
2. Muitos primers de oligo, sensores ou alvos de ASO que poderiam ser usados como modelo são muito curtos para efetivamente preparar e acionar a síntese de polimerase.
   
3. Muitos oligos terapêuticos artificiais são modificados quimicamente para facilitar meia-vida prolongada e funcionalidade aprimorada em circulação humoral, modificações que quase ou completamente proíbem sua interação com polimerases derivadas evolutivamente (isso se refere principalmente a espécies de oligos maiores, como mRNA).

Pesquisa e desenvolvimento contínuos para uma polimerase projetada capaz de síntese de ASO usando estoques de nucleotídeos quimicamente modificados

A natureza complexa da síntese de oligonucleotídeos poderia se beneficiar de um maior grau de observação do processo, compreendendo os desvios e mecanismos de reação e os controles acionáveis. A análise em tempo real com PAT poderia minimizar ou eliminar a necessidade de análises off-line demoradas ou lentas.

• ReactIR e ReactRaman podem ser usados para seguir a cinética das reações de síntese de oligonucleotídeos e comparações entre séries.
• Controle preciso de temperatura, agitação e dosagem com reatores de síntese química automatizados EasyMax junto com integração de tendências e mecanismos de reação facilita a captura de dados e o gerenciamento por meio do software iC

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy e Qunying Dai, "Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides", Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

Os autores observam que, embora os protocolos para síntese automatizada de oligonucleotídeos em fase sólida estejam bem estabelecidos, a química envolvida permanece desafiadora e custosa. Principais riscos identificados na produção incluem:

• Conexão de uma solução química incorreta para uma porta de entrada designada do sintetizador;
• Preparação quantitativa incorreta de uma solução;
• Erros que podem originar de fontes mecânicas ou desconhecidas associadas ao sintetizador

Falha para identificar e reagir a qualquer um desses riscos pode resultar em perda total do processo. Assim, foi avaliado o uso de monitoramento espectroscópico em tempo real associado à modelagem MSPC, quantitativa e distinta com base em dados de infravermelho médio. Descobriu-se que ReactIR proporciona garantia e controle em tempo real do processo de síntese e permite melhorada síntese de oligonucleotídeos automatizada. Em particular, a sensibilidade, profundidade informativa, amplo escopo e acessibilidade empírica desta abordagem foram considerados para permitir a aplicação pronta para um grande número de principais desafios de produção associados a esses compostos, sendo que o menos importante deles é a sequência on-line e a confirmação de pureza.

A capacidade de monitoramento em tempo real da Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier e Raman in situ para a química realizada em condições de fluxo está bem comprovada e é aplicável nas etapas principais da síntese de oligonucleotídeos.

• Síntese de monômeros de nucleotídeos para garantir estrutura e pureza
• Mitigue riscos causados por problemas mecânicos do sintetizador ou alimentação de solução incorreta
• Rastreie a reação de acoplamento do monômero de fosforamiditas ao grupo hidroxila livre no nucleotídeo ligado à fase sólida
• Rastreie a desnaturação e o recozimento de oligonucleotídeos complementares na síntese de filamento duplo.
• Determine a cinética da reação química em processo de recozimento — identifique e rastreie intermediários ou desconhecidos
• Correlacione as mudanças nos espectros com os pontos-chave do processo
• Aplicável a SPS, lote e síntese de peptídeo convergente (SPS + Fase de Solução)

Um ambiente de síntese bem controlado é vital para garantir resultado de reação. Plataformas de reatores automatizados proporcionam simultaneamente confiança e consistência através de todos os parâmetros críticos do processo.

• Um ambiente reprodutível é fundamental para bons fundamentos científicos
• Compreenda o impacto dos parâmetros do processo em atributos de qualidade essenciais combinando dados de sensores e PAT em linha
• Protocolo e automação atenuam riscos manuais ou inconsistências
• Facilite dados pesquisáveis e estruturados
• Confie em décadas de citações e evidências para aumento da balança
• Aplicável a SPS, lote e síntese de peptídeo convergente (SPS + Fase de Solução)