Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos pueden formarse enzimáticamente a través de la escisión de biomoléculas más grandes o mediante una síntesis química específica. En este último caso, la síntesis de organonucleótidos es el proceso químico por el que se sintetizan los fosforamiditos de nucleósidos, un elemento monomérico clave de los oligonucleótidos. Los fosforamiditos de nucleósidos (también conocidos como “nucleósidos” o “amidas” de forma abreviada) son en sí mismos derivados de nucleósidos naturales o sintéticos.

Los nucleótidos, por tanto, son moléculas compuestas que constan de un nucleósido unido de manera covalente y un grupo fosfato. Los nucleótidos se enlazan en una secuencia específica para formar el producto deseado. Así pues, los oligonucleótidos se componen de segmentos cortos de ácidos nucleicos que se unen entre sí para formar polímeros (“mer”) biológicos monocatenarios. Dado que la mayoría de los oligonucleótidos (u oligos de forma abreviada) suelen constar de hasta 20 nucleótidos enlazados (aunque es posible que haya más), puede pensarse en ellos como pequeñas moléculas biofarmacéuticas. 

Al igual que otras pequeñas moléculas de relevancia farmacéutica, la síntesis de oligonucleótidos requiere un control minucioso con respecto a la temperatura, el pH, la calidad de los sustratos, etc. Debido a los métodos típicos que se usan en la síntesis de oligonucleótidos, cuanto más larga y complicada sea la secuencia de nucleótidos, más difícil resultará cumplir los objetivos de rendimiento, pureza y costes. Las tecnologías analíticas de procesos (PAT) son muy útiles para lograr estos objetivos.

Los oligonucleótidos, u oligos, son segmentos cortos monocatenarios o bicatenarios de ácidos nucleicos que se unen entre sí para formar polímeros biológicos monocatenarios. Los pares de bases de nucleótidos individuales pueden considerarse equivalentes a los monómeros que componen los polímeros químicos clásicos. Un nucleótido consta de tres partes: una base que contiene nitrógeno, una molécula de azúcar con 5 carburos (estas dos partes son el nucleósido) y uno o más grupos fosfato. Por otro lado, los nucleótidos pueden componerse de bases no naturales o no canónicas. Entre algunos ejemplos comunes, se incluyen los LNA (ácidos nucleicos bloqueados), el morfolino y las bases o columnas modificadas estructuralmente. 

Los complejos enlaces de nucleótidos forman las biomoléculas de ARN y ADN críticas a nivel biológico. En el caso del ARN, que es un biopolímero monocatenario, el azúcar es ribosa. En el ADN, la molécula bicatenaria contiene azúcar desoxirribosa. Las secuencias cortas de ácidos desoxirribonucleicos y ribonucleicos son los componentes básicos de los importantes oligonucleótidos. Algunos ligamientos específicos de estos nucleótidos crean las biomoléculas objetivo que se usan en aplicaciones biológicas, médicas, forenses y clínicas. 

Cebadores y sondas de los oligonucleótidos

El uso más habitual de los oligonucleótidos sintéticos son las sondas y los cebadores relativamente breves (hasta 30 mer) en una amplia variedad de aplicaciones. Esto implica la sintetización de una secuencia de nucleótidos que está emparejada o es complementaria a la inversa con respecto a una cadena de ADN o ARN objetivo más grande (secuencia objetivo). Como cebadores, los oligonucleótidos suelen usarse para iniciar reacciones enzimáticas con el fin, por ejemplo, de crear entre millones y miles de millones de copias de una secuencia objetivo corta o larga. Entre algunos ejemplos comunes, se encuentran la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el método de secuenciación de Sanger. Las aplicaciones de los cebadores de oligonucleótidos incluyen la secuenciación del ADN, la expresión genética, la clonación y el diagnóstico molecular.

Como sondas, los oligonucleótidos sirven para identificar una secuencia objetivo de ADN o ARN específica y ligarse a ella con el fin de confirmar la presencia de esta secuencia en un material determinado. Entre las aplicaciones que emplean las sondas de oligonucleótidos, se incluyen los procedimientos de transferencia, como Northern blot (para ARN) o Southern blot (para ADN), como secuencias con fluorosforo en micromatrices que detectan cambios en la expresión genética o se usan en el cribado de trastornos genéticos o para identificar patógenos concretos (diagnósticos moleculares).

Tratamientos basados en oligonucleótidos y genoterapia

En las aplicaciones terapéuticas, los oligonucleótidos antisentido (ASO), generalmente especies de 20-30 mer, aprovechan la biología natural y facilitan la inhibición de genes o el silenciamiento génico (destrucción) de las secuencias de ARN no deseadas o demasiado activas, lo que, a su vez, bloquea la expresión de determinadas proteínas dañadas o demasiado activas que pueden causar o favorecer la enfermedad. Las investigaciones sobre tratamientos basados en oligonucleótidos se han intensificado enormemente y, en los últimos años, se han aprobado varios medicamentos.

Futuro uso de los nucleótidos sintéticos: exploración de las modalidades de vacunas de ADN y ARN

Aunque no se trata de un oligonucleótido en el estricto sentido del término, los productos de vacunas basados en ADN o ARN, como el ARNm o los ácidos nucleicos de plásmidos o vectores, de muchos cientos o miles de bases, representan la primera línea de la evolución de las tecnologías de los nucleótidos sintéticos.

En concepto, las vacunas de ADN o ARN prescindirían de todas las partes innecesarias o dañinas de una bacteria o virus patógeno. En cambio, una vacuna de este tipo basada en ácidos nucleicos contendría el código de tan solo algunas partes del ADN o ARN del patógeno. Estas cadenas de ADN o ARN indicarían al sistema inmunitario del paciente que produjera antígenos individuales o fragmentos del patógeno. Con la informática moderna y la creación de modelos por ordenador, estas modalidades de vacunas de oligonucleótidos pueden crearse en cuestión de días o semanas con una secuencia objetivo adecuada respecto a la que diseñar. Como tecnología de plataforma, las vacunas basadas en ácidos nucleicos se apoyan en conjuntos estándar de componentes básicos o materias primas que posibilitan innumerables combinaciones casi a voluntad. Como tales, también son relativamente baratas y fáciles de producir en comparación con las modalidades de vacunas tradicionales. Sin embargo, este sigue siendo un paradigma en desarrollo para la industria biofarmacéutica y constantemente se abordan nuevos retos, algunos exclusivos de los productos de oligonucleótidos y ácidos nucleicos largos, y otros compartidos con otras modalidades bioterapéuticas.

La síntesis de oligonucleótidos es el proceso químico mediante el que los nucleótidos se unen específicamente para formar el producto secuenciado deseado. Para producir oligonucleótidos, suele recurrirse a la síntesis continua de fase sólida con una columna de lecho empacado. En algunos casos, se emplea una reacción en lote de compuesto.

El proceso de producción de la secuencia de oligómeros objetivo conlleva varios ciclos que constan de pasos sintéticos específicos. En el primer paso, se elimina un grupo protector dimetoxitrilo 4,4’ en el nucleótido basado en la fase sólida. A continuación, se activa un monómero de fosforamidita y se acopla rápidamente a través del grupo hidroxilo libre en el nucleótido ligado de fase sólida para crear un dinucleósido que contenga un ligamiento de triéster de fosfito. En el tercer paso, el triéster de fosfito se oxida. En el último paso (del primer ciclo), los nucleósidos compatibles que no hayan reaccionado se “tapan” mediante acetilación para evitar que se formen productos secundarios no deseados en el siguiente ciclo.

La longitud de un oligonucleótido se define por el número de nucleótidos que componen la secuencia. En cuanto a la nomenclatura, una secuencia de 20 nucleótidos se define como “20 mer”. La longitud del oligonucleótido resulta esencial para las distintas aplicaciones. Por ejemplo, los oligonucleótidos de poca longitud suelen emplearse en la PCR, mientras que las secuencias muy largas (200 bases o más) se usan en aplicaciones exigentes tales como la clonación o la edición de CRISPR. La síntesis de oligonucleótidos especializados de gran longitud supone todo un reto y, para lograr una secuencia pura, se requiere tanto un control eficaz de la síntesis como métodos de purificación. De media, la mayoría de los oligonucleótidos tienen una longitud inferior a 60 mer. Dado que la forma en que se sintetizan los oligonucleótidos precisa de ciclos de reacción repetitivos que añaden más nucleótidos, cuanto más larga sea la secuencia requerida, mayor será la probabilidad de que se formen productos secundarios no deseados, que pueden incluir secuencias de deleción o truncamiento.

Se usan distintos métodos de purificación en función de los objetivos de calidad, cantidad y costes. Por ejemplo, a los oligonucleótidos sin sales se les eliminan los productos secundarios de la síntesis química, pero se conservan los fallos de secuencia. Estos oligonucleótidos sin sales resultan de utilidad desde el punto de vista del coste y la eficacia para aplicaciones más periódicas, como la PCR.  En el caso de las aplicaciones que son más exigentes, la cromatografía en fase inversa quita las secuencias no deseadas de un producto, pero no con la misma eficacia que la electroforesis con gel, que proporciona un producto de secuencias sumamente purificadas, pero por lo general en cantidades limitadas. En especial en lo que respecta a las aplicaciones clínicas, la continuidad del rendimiento es un aspecto que está siempre presente a lo largo de la síntesis y también en el procesamiento posterior.

La síntesis química clásica de fase sólida suele implicar el uso de polímeros o esferas de vidrio especializadas que no se ven afectados por las condiciones de reacción. Estas esferas pueden encontrarse en columnas en las que fluyen reactivos y disolventes. El objetivo de las esferas es servir como una plataforma en la que las moléculas del sustrato se unen de manera covalente y, luego, se actúa sobre ellas mediante una reacción química. La protección y desprotección de determinados grupos funcionales en la molécula del sustrato resultan clave para la síntesis y para asegurar la obtención del producto deseado. El producto de síntesis se elimina mediante la ruptura química del ligamiento entre él y la esfera de polímero subyacente. 

La síntesis de fase sólida es eficaz para obtener rápidamente un producto purificado, ya que las impurezas y los materiales que no han reaccionado se retiran en los distintos pasos de la síntesis. Además, todo el proceso de síntesis puede controlarse y automatizarse por ordenador.  La síntesis de fase sólida es el método más comúnmente empleado para la producción de péptidos y oligonucleótidos a medida. En este último caso, se requieren numerosos ciclos repetitivos para añadir los nucleótidos de modo secuencial a fin de formar la secuencia objetivo. 

La síntesis de oligonucleótidos de fase sólida presenta muchos retos, como la disminución del rendimiento a medida que aumenta la longitud de la cadena. Se suele proponer como hipótesis que el obstáculo estérico es un mecanismo de bajo rendimiento donde una o más cadenas fijadas a la superficie pueden interferir en cada elongación sucesiva de su vecina. 

Para hacer frente a estos y otros retos, hay varios métodos de síntesis de oligonucleótidos de fase líquida. 

Muchos pasos básicos de la síntesis de fase líquida son similares a los de la síntesis de fase sólida. La principal diferencia radica en que la síntesis tiene lugar en una solución o fase líquida (es decir, NO está fijada a ninguna superficie). Como este proceso sigue desarrollándose en ciclos, existen varios métodos complementarios para eliminar los reactivos que no han reaccionado al tiempo que se conserva el producto oligonucleótido elongado.

La técnica de usar la PCR para la síntesis de oligonucleótidos se implantó en el año 1985. En 1986, se usó por primera vez la enzima Taq polimerasa. Sin embargo, la síntesis de oligonucleótidos industrial ha tenido dificultades para adoptar la síntesis de oligonucleótidos enzimática por tres motivos fundamentales:

1. La síntesis enzimática requiere una plantilla en la que pueda funcionar la enzima ADN polimerasa que extiende la secuencia. Como tal, la síntesis de oligonucleótidos de novo mediante la enzima no puede funcionar sin una plantilla. 
   
2. Muchos cebadores de oligonucleótidos, sondas u objetivos de ASO que podrían emplearse como plantilla son demasiado cortos para cebar y desencadenar eficazmente la síntesis de polimerasa.
   
3. Muchos oligonucleótidos terapéuticos artificiales se modifican químicamente para prolongar la vida media y mejorar la funcionalidad en la circulación humoral, modificaciones que prohíben parcial o totalmente su interacción con polimerasas derivadas evolutivas (esto se refiere principalmente a especies de oligonucleótidos más largas, como el ARNm).

Se sigue investigando y desarrollando una idea de polimerasa capaz de realizar la síntesis de ASO mediante reservas de nucleótidos modificados químicamente.

La compleja naturaleza de la síntesis de oligonucleótidos podría beneficiarse de un mayor grado de observación de los procesos, de comprensión de los mecanismos de reacción y de las desviaciones, y de controles procesables. Los análisis en tiempo real con PAT podrían reducir al mínimo o eliminar la necesidad de realizar análisis fuera de línea que llevan mucho tiempo o son lentos.

• Los sistemas ReactIR y ReactRaman pueden usarse para seguir la cinética de las reacciones de síntesis de oligonucleótidos y las comparaciones de un ciclo a otro.
• El control preciso de la temperatura, la agitación y la dosificación con los reactores automatizados de síntesis química EasyMax, junto con la integración de las tendencias y mecanismos de reacción, favorece la captura de datos y la facilidad de gestión mediante el software iC.

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy y Qunying Dai, “Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides”, Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

Los autores señalan que, aunque los protocolos de la síntesis de oligonucleótidos de fase sólida automatizada están consolidados, la química implicada sigue resultando difícil y costosa. Entre los principales riesgos identificados en la fabricación, se incluyen:

• Conexión de una solución química incorrecta a un puerto de entrada designado del sintetizador.
• Preparación cuantitativa equivocada de una solución.
• Errores que pueden provenir de fuentes mecánicas u otros orígenes desconocidos asociados al sintetizador.

El hecho de no identificar cualquiera de estos riesgos ni reaccionar a ellos puede provocar la pérdida completa del proceso. Así pues, se evaluó el uso de un control espectroscópico en tiempo real junto con una creación de modelos discriminada, cuantitativa y de MSPC basada en datos del infrarrojo medio. Se observó que el sistema ReactIR aportaba seguridad y control en tiempo real al proceso de síntesis y mejoraba la síntesis de oligonucleótidos automatizada. En particular, se determinó que la sensibilidad, la profundidad de la información, el amplio alcance y la accesibilidad empírica de este enfoque posibilitaban una fácil aplicación a muchos de los principales retos de fabricación relacionados con estos compuestos, entre los que destaca la confirmación de la pureza y la secuencia en línea.

Las capacidades de control en tiempo real de la espectroscopia FTIR in situ y Raman para los procesos químicos que se llevan a cabo en condiciones de flujo están más que demostradas y pueden aplicarse en pasos clave de la síntesis de oligonucleótidos.

• Síntesis de monómeros de nucleótidos para asegurar la estructura y la pureza.
• Mitigación de riesgos provocados por problemas mecánicos del sintetizador o por alimentaciones de soluciones incorrectas.
• Seguimiento de la reacción de acoplamiento del monómero de fosforamidita al grupo hidroxilo libre en el nucleótido ligado de fase sólida.
• Seguimiento de la desnaturalización y la alineación de oligonucleótidos complementarios en la síntesis bicatenaria.
• Determinación de la cinética de reacción química en el proceso de alineación: identificación y seguimiento de intermediarios o desconocidos.
• Correlación de los cambios en los espectros con los puntos clave del proceso.
• Aplicable a síntesis SPS, por lotes y de péptidos convergentes (SPS y fase de solución).

Resulta esencial disponer de un entorno de síntesis bien controlado para asegurar el resultado de la reacción. Las plataformas de reactores automatizados ofrecen confianza y uniformidad en todos los parámetros críticos del proceso simultáneamente.

• Es fundamental tener un entorno reproducible para realizar experimentos correctos.
• Se debe comprender el impacto de los parámetros del proceso en los atributos críticos de calidad mediante la combinación de los datos de los sensores y la PAT en línea.
• El protocolo y la automatización mitigan las incoherencias o los riesgos manuales.
• Se debe facilitar la búsqueda y estructuración de los datos.
• Se puede confiar en décadas de citas y pruebas para el escalado.
• Aplicable a síntesis SPS, por lotes y de péptidos convergentes (SPS y fase de solución).