Oligonukleotidsynthese

Oligonukleotide können entweder enzymatisch durch die Spaltung grösserer Biomoleküle oder durch gezielte chemische Synthese gebildet werden. Im letztgenannten Fall versteht man unter Oligonukleotidsynthese den chemischen Prozess der Synthese von Nukleosid-Phosphoramiditen, eines wichtigen Monomerbausteins von Oligonukleotiden. Diese Nukleosid-Phosphoramidite (auch kurz Nukleoside oder Amidite) sind wiederum Derivate natürlicher oder synthetischer Nukleoside.

Nukleotide sind zusammengesetzte Moleküle, in denen ein Nukleosid und eine Phosphatgruppe kovalent miteinander verbunden sind. Um ein Zielprodukt zu erhalten, werden die Nukleotide dann in einer bestimmten Sequenz miteinander verknüpft. Oligonukleotide bestehen also aus kurzen Segmenten von Nukleinsäuren, die nach dem Verknüpfen einkettige Biopolymere bilden. Da die meisten Oligonukleotide (oder einfach Oligos) für gewöhnlich aus bis zu 20 miteinander verknüpften Nukleotiden bestehen (mehr sind auch möglich) , können sie als kleine biopharmazeutische Moleküle angesehen werden. 

Ganz so wie bei Synthesen anderer kleiner Biopharma-Moleküle ist bei der Oligonukleotidsynthese eine sorgfältige Kontrolle von u. a. Temperatur, pH-Wert und Substratqualität unerlässlich. Bei der Oligonukleotidsynthese kommen hoch spezialisierte Verfahren zum Einsatz. Je länger und komplizierter die gewünschte Nukleotidsequenz, desto schwieriger gestaltet sich daher die Einhaltung der Produktionsziele in puncto Ausbeute, Reinheit und Wirtschaftlichkeit. Da können Prozessanalyse-Technologien oder PATs helfen.

Oligonukleotide oder auch Oligos sind kurze ein- oder zweisträngige Segmente von Nukleinsäuren, die so miteinander verknüpft werden, dass ein einkettiges Biopolymer entsteht. Die einzelnen Basenpaare eines Nukleotids entsprechen im Prinzip den Monomeren, aus denen klassische chemische Polymere bestehen. Ein Nukleotid besteht aus drei Teilen: einer Base mit einem Stickstoffatom, einem Zuckermolekül aus fünf C-Atomen (beides zusammen ergibt das Nukleosid) und  einer oder mehreren Phosphatgruppen. Alternativ können Nukleotide auch nicht natürlich vorkommende oder nicht kanonische Basen enthalten. Beispiele sind LNA (Locked Nucleic Acids, verbrückte Nukleinsäuren), Morpholino-Oligomere und strukturmodifizierte Basen oder Backbones. 

Die komplexe Verknüpfung von Nukleotiden führt zu den biologisch so wichtigen Biomolekülen RNA und DNA. Bei der RNA, einem einsträngigen Biopolymer, ist das zugrundeliegende Zuckermolekül Ribose. Die zweisträngige DNA enthält als Zucker hingegen Desoxyribose. Die kurzen Sequenzen von Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure sind die Bausteine wichtiger Oligonukleotide. Durch gezieltes Verknüpfen dieser Nukleotide lassen sich nämlich ganz bestimmte Biomoleküle herstellen, die dann in der Biologie, der Medizin, der Forensik und der Klinik Anwendung finden. 

Oligonukleotid-Primer und -Sonden

Am verbreitetsten ist die Verwendung synthetischer Oligonukleotide als kürzere Primer und Sonden (bis zu 30 Monomere) in einer Vielzahl von Applikationen. Dabei wird eine Nukleotidsequenz synthetisiert, die umgekehrt komplementär zu einem grösseren Ziel-DNA- oder RNA-Strang, der Zielsequenz, ist. Als Primer initiieren Oligos enzymatische Reaktionen, mit deren Hilfe dann eine kürzere oder längere Zielsequenz milliardenfach kopiert werden kann. Bekannte Beispiele sind die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder die Sanger-Methode der DNA-Sequenzierung. Applikationen für Oligo-Primer umfassen die DNA-Sequenzierung, die Genexpression, die Klonierung sowie die molekulargenetische Diagnostik.

Oligo-Sonden helfen dabei, spezifische DNA- oder RNA-Zielsequenzen zu identifizieren. Sie binden an diese und belegen so die Anwesenheit dieser bestimmten Sequenz in einem Probenmaterial. Zu den Applikationen, bei denen Oligo-Sonden eingesetzt werden, gehören Blotting-Verfahren wie das Northern Blotting (für RNA) oder das Southern Blotting (für DNA), an Fluorophore gekoppelte Sequenzen in Microarrays zum Nachweis von Veränderungen in der Genexpression, für das Screening auf genetische Krankheiten oder zur Identifizierung bestimmter Krankheitserreger.

Oligo-Therapeutika/Gentherapie

In therapeutischen Applikationen nutzt man mit Antisense-Oligonukleotiden (ASO) aus 20- bis 30-meren natürliche biologische Zusammenhänge für die Genhemmung oder das Stummschalten (Zerstören) bestimmter unerwünschter oder überaktiver RNA-Sequenzen. So wird die Expression geschädigter oder überaktiver Proteine blockiert, die Krankheiten verursachen oder begünstigen können. Die Forschung zu Oligo-basierten Therapeutika hat in den zurückliegenden Jahren einen enormen Aufschwung erfahren. Im Zuge dessen wurde eine Vielzahl neuer Wirkstoffe zugelassen.

Die Zukunft synthetischer Nukleotide: Erforschung von DNA- und RNA-Impfstoffmodalitäten

Streng genommen handelt es sich dabei zwar nicht um Oligonukleotide, doch Impfstoffe auf DNA- oder RNA-Basis, wie mRNA-, Plasmid- oder Vektor-basierte Nukleinsäuren mit einer Länge von vielen Hunderten oder Tausenden von Basen, sind die Speerspitze der neuen Synthesetechnologien.

Bei DNA- oder RNA-Impfstoffen müssen keine unnötigen oder schädlichen Bestandteile eines Bakteriums oder Virus mehr injiziert werden. Stattdessen enthält ein solcher Impfstoff auf Nukleinsäure-Basis den Code für nur wenige Teile der DNA oder RNA dieses Krankheitserregers. Diese DNA- oder RNA-Stränge sind es dann, die das Immunsystem des Patienten dazu anregen, bestimmte Antigene oder Fragmente des Krankheitserregers zu produzieren. Moderne Computertechnik und die In-silico-Modellierung erlauben die Entwicklung von Oligonukleotid-Impfstoffen in nur wenigen Tagen oder Wochen. Es muss nur eine geeignete Zielsequenz zur Verfügung stehen. Impfstoffe auf Basis von Oligonukleotiden stellen eine Plattformtechnologie dar. Sie nutzen Standard-Bausteine oder Ausgangsstoffe und ermöglichen so zahllose verschiedene Kombinationen. Damit sind sie im Vergleich zu traditionellen Impfstoffmodalitäten auch relativ wirtschaftlich und einfach herzustellen. Ausgereift ist dieser Ansatz in der biopharmazeutischen Industrie allerdings noch nicht. So sind ständig neue Herausforderungen zu bewältigen, von denen einige nur Oligo- und lange Nukleinsäureprodukte betreffen während andere mit anderen biotherapeutischen Modalitäten geteilt werden.

Die Oligonukleotidsynthese ist ein chemisches Verfahren, bei dem Nukleotide gezielt so miteinander verknüpft werden, dass ein Produkt mit der gewünschten Sequenz entsteht. Zur Herstellung von Oligonukleotiden wird üblicherweise die kontinuierliche Festphasensynthese mittels Festbettsäule verwendet. Mitunter kommt auch eine Slurry-Reaktion zum Einsatz.

Der Prozess zur Herstellung der Ziel-Oligomersequenz erfordert mehrere Zyklen, die aus ganz bestimmten Syntheseschritten bestehen. Im ersten Schritt wird eine 4,4'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe des an den Festphasenträger kondensierten Nukleotids entfernt. Dann wird ein Phosphoramidit-Monomer aktiviert und mittels der freien Hydroxylgruppe unmittelbar an das Nukleotid an der Festphase gekoppelt. Es entsteht ein Dinukleosid mit einem Phosphittriester. Im dritten Schritt wird der Phosphittriester oxidiert. Der letzte Schritt (des ersten Zyklus) ist das Capping, bei dem nicht umgesetzte Nukleoside durch Acetylierung inaktiviert werden. Dies verhindert die Bildung unerwünschter Nebenprodukte im nächsten Zyklus.

Die Länge eines Oligonukleotids ergibt sich aus der Anzahl der Nukleotide, aus denen die Sequenz besteht. Der Nomenklatur nach wird eine Sequenz aus 8 Nukleotiden beispielsweise als „Oktamer“ bezeichnet. Die Länge der Oligos ist für die verschiedenen Applikationen entscheidend. So werden etwa kürzere Oligos häufig für die PCR verwendet. Sehr lange Sequenzen (aus 200 Basen oder mehr) finden Einsatz in anspruchsvollen Anwendungen wie der Klonierung oder der CRISPR-Editierung. Die Herstellung spezialisierter langer Oligos ist eine Herausforderung. Für eine hochreine Zielsequenz müssen sowohl die Synthese als auch die Aufreinigung effektiv sein. Im Schnitt sind die meisten Oligos kürzer als 60 Einheiten. Da die Synthese von Oligos wiederholte Reaktionszyklen für das Anfügen weiterer Nukleotide erfordert, wächst das Risiko für die Bildung unerwünschter Nebenprodukte (darunter Deletion oder Trunkierung von Sequenzen) mit der Länge der erforderlichen Sequenz.

Je nach angestrebter Qualität, Quantität und Wirtschaftlichkeit werden unterschiedliche Aufreinigungsverfahren eingesetzt. Bei salzfreien Oligos werden beispielsweise Nebenprodukte der chemischen Synthese entfernt. Sequenzfehler bleiben jedoch bestehen. Solche salzfreien Oligos bieten sich aus Kosten- und Effizienzsicht zumindest für Routineapplikationen, wie z. B. die PCR, an.  Für anspruchsvollere Applikationen werden mittels Umkehrphasenchromatographie unerwünschte Sequenzen aus einem Produkt entfernt. Noch effektiver wäre die Gelelektrophorese. Sie liefert ein hochreines Produkt, ist jedoch im Grossmassstab meist nicht wirtschaftlich. Speziell bei klinischen Applikationen ist die Sicherung der Ausbeute während der Synthese und Weiterverarbeitung ein ständiges Thema.

Bei der klassischen chemischen Festphasensynthese werden meist Perlen aus einem Polymer oder einem Spezialglas verwendet, die gegenüber den Reaktionsbedingungen inert sind. Diese Perlen oder Beads können in Säulen gepackt sein, durch die dann die Reaktanten, Reagenzien und Lösungsmittel fliessen. Ihre Funktion besteht darin, als Plattform zu fungieren, an die die Substratmoleküle kovalent gebunden und dann durch weitere chemische Reaktionen modifiziert werden. Durch die Kopplung und Entfernung von Schutzgruppen an bestimmten funktionellen Gruppen des Substratmoleküls wird die Synthese ermöglicht und sichergestellt, dass das gewünschte Produkt entsteht. Das Syntheseprodukt wird entfernt, indem die Bindung an die Trägerbeads aufgebrochen wird. 

Mit der Festphasensynthese lassen sich schnell reine Produkte erzielen, da Verunreinigungen und nicht umgesetzte Ausgangsstoffe in den einzelnen Syntheseschritten ausgewaschen werden. Zudem lässt sich die gesamte Synthese gut per Computer steuern und automatisieren.  Daher ist die Festphasensynthese die häufigste Methode für die Herstellung massgeschneiderter Peptide und Oligonukleotide. Für letztere müssen viele immer gleiche Zyklen ablaufen, damit nach und nach die einzelnen Nukleotide für die gewünschte Zielsequenz angefügt werden können. 

Die Festphasensynthese von Oligonukleotiden bringt viele Herausforderungen mit sich. Eine ist die mit zunehmender Sequenzlänge abnehmende Ausbeute. Die sterische Hinderung wird oft als ursächlich für eine unzureichende Ausbeute angenommen. Dabei stören einer oder mehrere an der Festphasenoberflächen fixierte Stränge jede weitere Anfügung an den Nachbarstrang. 

Diesen und anderen Herausforderungen kann mit verschiedenen Methoden der Flüssigphasensynthese begegnet werden. 

Viele grundlegende Schritte der Flüssigphasensynthese entsprechen denen der Festphasensynthese. Der zentrale Unterschied liegt darin, dass die Synthese hier in Lösung oder in einer Flüssigphase abläuft (d. h. die Moleküle werden NICHT an eine Oberfläche gebunden). Da auch dieses Verfahren sich wiederholende Zyklen erfordert, werden mittels mehrerer begleitender Techniken nicht umgesetzte Reagenzien entfernt, während das stetig wachsende Oligonukleotidprodukt erhalten bleibt.

Die Technik, PCR für die Oligonukleotidsynthese zu verwenden, wurde erstmals 1985 wissenschaftlich beschrieben. 1986 wurde die erste Anwendung des Enzyms Taq- Polymerase vorgestellt. Bis heute konnte die enzymatische Oligonukleotidsynthese im industriellen Kontext jedoch nicht wirklich Fuss fassen. Das hat drei Hauptgründe:

1. Die enzymatische Synthese braucht immer eine Vorlage, mit der das sequenzverlängernde DNA-Polymerase-Enzym arbeiten kann. Eine De-novo-Synthese von Oligonukleotiden mittels Enzymen kann ohne eine solche Vorlage nicht gelingen. 
   
2. Viele Oligo-Primer, -Sonden oder ASO-Targets, die als Vorlage dienen könnten, sind aber zu kurz für das Priming und das Anstossen einer Polymerasesynthese.
   
3. Viele synthetische Oligo-Therapeutika werden so verändert, dass die Halbwertszeit verlängert und die Funktionalität in der Zellflüssigkeit verbessert werden. Solche Veränderungen verhindern die Interaktion mit natürlichen Polymerasen nahezu vollständig (das ist vor allem bei den längeren Oligos wie der mRNA der Fall).

Forschung und Entwicklung arbeiten weiterhin daran, Polymerasen zu entwickeln, die mittels chemisch modifizierter Nukleotid-Bouillons ASOs synthetisieren können.

Wegen ihrer Komplexität könnte die Oligonukleotidsynthese von einer engmaschigeren Prozessüberwachung, transparenteren Reaktionsmechanismen und zeitnaher Detektion von Abweichungen sowie von aufschlussreichen Steueroptionen profitieren. Die Echtzeitanalyse mittels PATs könnte zeitaufwändige oder langsame Offline-Analysen minimieren oder ganz überflüssig machen.

• ReactIR und ReactRaman sind für die Verfolgung der Reaktionskinetik bei der Oligonukleotidsynthese und den Vergleich verschiedener Durchläufe gut geeignet.
• Die präzise Kontrolle von Temperatur, Rührrate und Dosierung mit den automatischen EasyMax Reaktoren für die chemische Synthese sowie die Integration von Reaktionstrends und -mechanismen ermöglichen die Datenerfassung und einfache Verwaltung mittels iC- Software.

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy, and Qunying Dai, „Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides“, Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

Die Autoren merken an, dass trotz gut etablierter Protokolle für die automatisierte Festphasen-Oligonukleotidsynthese die zum Einsatz kommenden chemischen Verfahren weiterhin komplex und kostspielig sind. Zu den wichtigsten Risiken bei der Herstellung gehören:

• Anschluss der falschen chemischen Lösung an einen bestimmten Eingang des Synthesegeräts;
• Falsche Zubereitung einer Lösung;
• Fehler mechanischer oder anderer unbekannter Art am Synthesegerät.

Bleibt davon ein Risiko unerkannt, kann dies zum Fehlschlagen des ganzen Prozesses führen. Daher wurde die Verwendung der Echtzeit-Spektroskopieüberwachung in Verbindung mit einer diskriminativen, quantitativen und MSPC-Modellierung auf der Grundlage von Daten im mittleren Infrarotbereich evaluiert. ReactIR konnte erwiesenermassen die Prozesssicherheit erhöhen und ermöglichte eine Echtzeitkontrolle der Synthesebedingungen. So konnte die automatisierte Synthese von Oligonukleotiden verbessert werden. Insbesondere Sensitivität, Informationstiefe, umfassende Eignung und empirische Zugänglichkeit dieses Ansatzes sprachen für die unmittelbare Anwendung auf viele der zentralen Herausforderungen bei der Herstellung. Auch und gerade die Onlinebestätigung von Sequenz und Reinheit ist ein Pluspunkt.

Die Möglichkeiten zur Echtzeitüberwachung von Synthesen, die unter Strömungsbedingungen ablaufen, mit der In-situ-FTIR- und Raman-Spektroskopie sind bewährt und auf die wichtigsten Schritte der Oligonukleotidsynthese anwendbar.

• Synthese von Nukleotidmonomeren, um die Reinheit und die korrekte Zielstruktur sicherzustellen
• Minderung von Risiken infolge mechanischer Probleme des Synthesegeräts oder der Zufuhr falscher Lösungen
• Verfolgen der Kopplung des Phosphoramidit-Monomers an die freie Hydroxylgruppe des festphasengebundenen Nukleotids
• Verfolgen von Denaturierung und Hybridisierung komplementärer Oligonukleotide bei der Doppelstrangsynthese
• Bestimmen der Reaktionskinetik bei der Hybridisierung – Identifizieren und Verfolgen von Zwischenprodukten und Unbekannten
• Korrelation von Änderungen im Spektrum mit Schlüsselmomenten im Prozess
• Für SPS, Batch und konvergente Peptidsynthese (SPS + Lösungsphase)

Eine effizient gesteuerte Syntheseumgebung ist für ein zufriedenstellendes Reaktionsergebnis entscheidend. Mit automatischen Reaktorplattformen erlangen Wissenschaftler Gewissheit über und Konsistenz für alle kritischen Prozessparameter gleichzeitig.

• Eine reproduzierbare Umgebung ist grundlegend für solide wissenschaftliche Erkenntnisse
• Verstehen der Auswirkungen von Prozessparametern auf qualitätsentscheidende Attribute durch Kombination von Sensordaten und Inline-PAT
• Protokolle und Automatisierung mindern die Risiken oder Inkonsistenzen infolge manueller Schritte
• Leichter durchsuchbare und besser strukturierte Daten
• Mit der Kompetenz von jahrzehntelanger wissenschaftlicher Erfahrung und Skalierungserfolgen
• Für SPS, Batch und konvergente Peptidsynthese (SPS + Lösungsphase)