Virusinaktivierung in der Bioverarbeitung

Die Virusinaktivierung ist der erste von üblicherweise zwei Schritten zur Steigerung der Sicherheit von biotherapeutischen Produkten. Während der Inaktivierung werden Viren jeder Art innerhalb der gepoolten und teilweise aufgereinigten therapeutischen Suspension bewusst zerstört oder apathogen gemacht. Dies erfolgt normalerweise durch Änderung der Umgebung des Virus, um die virale Struktur irreversibel aufzubrechen und zu denaturieren.

Dies erfolgt normalerweise durch Änderung der Umgebung des Virus, um die virale Struktur irreversibel aufzubrechen und zu denaturieren  – z. B. mithilfe von chemischen, physikalischen oder sogar energetischen Methoden. Die Virusentfernung verläuft separat und auf anderem Wege als die Inaktivierung, da es sich dabei um einen ergänzenden, die Virussicherheit erhöhenden Vorgang handelt, der die Virussicherheit erhöht, indem das Virus eliminiert oder von dem Protein/den Proteinen oder den jeweiligen Produkten getrennt wird.

Viele biotherapeutische Produkte enthalten Viren oder können mit diesen während der Produktion oder Verarbeitung kontaminiert werden. Die Pathogenität und die Virenlast oder -menge müssen in diesen Modalitäten mithilfe einer Inaktivierung und Entfernung eliminiert bzw. beseitigt werden, um den Patienten zu schützen; diese Verfahren sind normalerweise nur in Kombination wirksam. Abhängig von den spezifischen Eigenschaften des Virus und der Art des biotherapeutischen Produkts können mehrere Verfahren zur Inaktivierung und Entfernung des Virus verwendet werden. Für viele Arbeitsabläufe in der biotherapeutischen Verarbeitung wird eine Kombination komplementärer Verfahren angewandt, um das Spektrum an Viren, die in ausreichendem Masse eliminiert werden können, zu erweitern.

Inaktivierung
Es können mehrere Verfahren zur Deaktivierung von Viren angewandt werden. Am häufigsten finden Anwendung:

• Verfahren auf Grundlage eines niedrigen pH-Werts – besonders bei biotherapeutischen Produkten wie monoklonalen Antikörpern (mAbs)
• Verfahren auf Grundlage von Lösemitteln oder Tensiden – hauptsächlich bei Polysacchariden

Zu den seltener eingesetzten Verfahren zur Virusinaktivierung zählen Pasteurisierung und Verfahren mit trockener Wärme und Dampfwärme – besonders bei Produkten auf Blut- oder Serumbasis.

Virusentfernung
Zu den am besten dokumentierten Verfahren der Virusentfernung gehören Ausfällung, Chromatographie und Nanofiltration.

Die Auswahl der anzuwendenden Verfahren für die Inaktivierung und Entfernung von Viren hängt von der Grösse, dem Typ und der Instabilität des herzustellenden biotherapeutischen Produkts, dem/den Reinigungsverfahren, das der Hersteller anwenden möchte, und von den Eigenschaften des jeweiligen Virus ab. Struktur und Funktion des Arzneistoffes sind neben der Virussicherheit ebenso wichtige Qualitätsattribute, die durchgehend evaluiert und aufrechterhalten werden müssen. Jedes Verfahren zur Virusinaktivierung – niedriger pH-Wert oder Tensid – wird durch die präzise und parallele Steuerung mehrerer kritischer Prozessparameter begünstigt. Dies ist erforderlich, um ein Verständnis über den Prozess selbst und über die Wirkung eines Arzneistoffs zu entwickeln. Reaktoren für die chemische Synthese ermöglichen die Analyse eines modernen Prozesses und den fortlaufenden Betrieb innerhalb eines festgelegten Parameterbereichs. Ausserdem dienen sie der Modellierung von Methodentransfers und Skalierungsprozessen.

Die Virusinaktivierung für biotherapeutische Produkte mithilfe eines niedrigen pH-Werts hängt bekanntermassen von den Faktoren pH-Wert, Dauer, Temperatur, Proteingehalt und Solvat- oder Puffergehalt ab. Viele Viren werden bei einem pH-Wert von 5,0–5,5 irreversibel denaturiert und effektiv zerstört. Je nach Umfang der Viren, die deaktiviert und entfernt werden sollen, kann dieser Bereich ausreichend sein. Viele behüllte Viren können jedoch erst bei einem pH-Wert von 3,5–4 effektiv deaktiviert werden.

Viele biotherapeutische mAb-Produkte erfordern ein besonders umfangreiches Entfernen verschiedener Virustypen, sodass meistens ein „niedriger“ pH-Wert von 3,5–4 angewendet wird. Werden manche biotherapeutische Produkte diesem pH-Wert jedoch über einen zu langen Zeitraum ausgesetzt, können sie beschädigt oder deaktiviert werden. Dies trifft v. a. auf Enzyme wie Blutproteine, Insulin o. Ä. zu (Abbildung B). Bei längerer pH-Belastung stellt sich bei Proteinen und Enzymen eine erhebliche Deamidierung, Denaturierung und Aggregation ein. Immunoglobulin-Lösungen (einschliesslich IgG- und IgM-mAbs) sind bei einem pH-Wert von 3,5–5,5 normalerweise weniger anfällig als Proteine oder Enzyme – dennoch bleiben sie anfällig, wenn auch in unterschiedlichem Masse. Bei ausreichender Dauer unter viralen Deaktivierungsbedingungen dürfte die Belastung durch infektiöse Viren auf ein Minimum beschränkt sein. Dennoch kann es dazu kommen, dass verbleibende Viruspartikel, Ablagerungen o. Ä. noch nicht physisch entfernt wurden (Abbildung C).

Bei Immunglobulin-mAb-Produkten ist die Verwendung eines niedrigen pH-Werts die gängigste Methode zur Virusinaktivierung, da sie relativ leicht anzuwenden ist, minimalen Platzbedarf aufweist und normalerweise wenig Eingriffe oder zusätzliche Schritte bei der Entfernung erfordert – ganz im Gegensatz zu Tensiden oder anderen Lösemitteln. Trotzdem variieren die geeigneten und optimalen Bedingungen sowie das erforderliche Spektrum für die Entfernung von Viren von Molekül zu Molekül. Aus diesem Grund sind für jedes Molekül Studien zur Bestimmung und Validierung des Gestaltungsraums oder der betrieblichen Grenzen notwendig, in denen eine effektive Virusinaktivierung stattfinden kann. Diese Grenzen und das Ergebnis eines Virusinaktivierungsprozesses werden normalerwiese durch alle (oder zumindest einige) Variablen oder kritischen Prozessparameter (Critical Process Parameters, CPPs) bestimmt, die das Ergebnis einer Virusinaktivierung und somit die Qualität eines Arzneistoffs beeinflussen. Die Erkennung und Steuerung dieser Faktoren wirkt sich positiv auf die Produktqualität und -quantität aus.

Normalerweise werden Studien zur Virusinaktivierung mithilfe eines niedrigen pH-Werts mit einer bestimmten Immunoglobulin-Lösungsmenge und -Konzentration in einem Gefäss wie einem Becher mit Magnetrührer durchgeführt. Da für das meiste Material einer Studie Immunoglobulinlösungen verwendet werden, die einen anfänglichen pH-Wert aufweisen, der physiologischen Bedingungen gleichkommt, sollen mithilfe der Studien die Parameter der Reagenzzufuhr erläutert werden. Normalerweise wird eine manuelle Titration mit einer Bürette oder einer Pipette durchgeführt, während periodisch die pH-Messung aufgezeichnet wird. Nach Einhaltung einer vorgeschriebenen Zeitfrist und anderer Parameter bei einem pH-Wert, der niedrig genug ist, um den anvisierten Virengehalt zu inaktivieren, wird der Arzneistoff oder die Immunoglobulinlösung aus dem niedrigen pH-Bereich in einen geeigneten physiologischen oder leicht basischen Bereich zurücktitriert wird. Dies ist die Vollendung der Virusinaktivierung mithilfe eines niedrigen pH-Werts. Dennoch sind für die gesamte Studie zur Virusinaktivierung mittels niedrigem pH-Wert und Titration Probennahmen für die Offline-Analyse erforderlich, um verschiedene Qualitätseigenschaften wie z. B. Aggregation oder Deamidierung mithilfe von Verfahren wie Grössenausschluss-Chromatographie (SEC) dokumentieren zu können. Qualifizierte Wissenschaftler können zwar die notwendige Präzision erreichen, allerdings ist der Prozess der Virusinaktivierung typischerweise mühsam und wird von den natürlichen Abweichungen, Ungenauigkeiten und Herausforderungen bei der Reproduzierbarkeit manueller Prozesse beeinträchtigt.

Während Studien zur Virusinaktivierung mithilfe niedriger pH-Werte in nachgelagerten Bioprozessen durchgeführt werden, um die erforderliche Menge zuzuführender Reagenzien und die für den Prozess erforderliche Zeit zu ermitteln, ist auch die Bestimmung der Prozesskinetik und des Einflusses erschwerender Prozessparameter von grosser Wichtigkeit und letztendlich erforderlich, um einen robusten und optimierten Prozess einer Virusinaktivierung zu gewährleisten. Dennoch werden Temperaturüberwachung und -kontrolle häufig nicht ausreichend beachtet und sind daher ein unkontrollierter Parameter bei Prozessentwicklungsstudien für die Virusinaktivierung.

Dieses Nichtbeachten ist teilweise auf die Verwendung von Pilot- oder sogar kommerziellen Systemen im Produktionsmassstab zurückzuführen, mit denen Virusinaktivierungen in in Aufbewahrungs- oder Übertragungsgefässen durchgeführt werden, die die Temperatur gegebenenfalls aufzeichnen, aber nicht kontrollieren. Die Repräsentativität des Massstabs, insbesondere die Repräsentativität des Mischens, ist ebenfalls ein häufig übersehener Parameter in Studien zur Virusinaktivierung mithilfe eines niedrigen pH-Werts, die z. B. mithilfe von durch magnetische Rührplatten gesteuerten manuellen Plattformen durchgeführt werden. Aufgrund fehlender Datenerfassungen zu simplen Vorgängen wie dem Mischen kann nicht überprüft werden, ob die Bedingungen der Studie tatsächlich korrekt und konsistent waren. 

Der Betrieb der Einheit für die Virusinaktivierung mithilfe eines niedrigen pH-Werts stellt ein potenzielles Risiko für die Produktaggregation im Prozess während der nachgelagerten Verarbeitung eines monoklonalen Antikörpers dar. In dieser Präsentation von Hiren D. Ardeshna von GlaxoSmithKline wird der vollfaktorielle Experimentaufbau zur Untersuchung der Auswirkung folgender vier Parameter erläutert:

• Niedrigster pH-Wert
• Kürzeste pH-Wert-Wirkzeit
• Kürzeste pH-Wert-Titrationsdauer
• Dauer der Neutralisierungstitration

Die Virusinaktivierung mittels Solvent/Detergent-Verfahren wird häufig zur Bekämpfung behüllter Viren eingesetzt. Allgemein verwendete Reagenzien haben einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Labilität des therapeutischen Proteins oder der therapeutischen Antikörper, die den Herausforderungen der Denaturierung oder Deamidierung ausgesetzt sind, die bei manchen Methoden mit niedrigem pH-Wert auftreten können. Die Virusinaktivierung mittels Solvent/Detergent-Verfahren hat ähnliche Anforderungen und Voraussetzungen wie Methoden mit geringem pH-Wert. Prinzipiell dienen sie dazu, die erforderliche Menge an zuzuführenden Reagenzien (in diesem Fall ein Löse- oder Reinigungsmittel) und die benötigte Zeit für den Prozess zu bestimmen. Wie bei der Virusinaktivierung mithilfe eines niedrigen pH-Werts variieren die Bedingungen bei Immunoglobulinen und anderen Arzneimitteltypen. Aus diesem Grund sind für jedes Molekül Studien zur Bestimmung und Validierung des Gestaltungsraums oder der betrieblichen Grenzen notwendig, in denen eine effektive Virusinaktivierung mittels Solvent/Detergent-Verfahren stattfinden kann. Diese Grenzen und das Ergebnis eines Virusinaktivierungsprozesses werden ebenfalls durch kritische Prozessparameter bestimmt, einschliesslich Temperatur, Proteingehalt, Lösemittel- oder Reinigungsmittelgehalt, Dauer der Inaktivierungsbedingungen sowie Mischen und Effizienz der Löse- oder Reinigungsmittel-Homogenisierung. Die Erkennung und Steuerung dieser Faktoren wirkt sich positiv auf die Produktqualität und -quantität aus.

Auch wenn Studien zur Virusinaktivierung mittels Detergent-Verfahren nicht die gleiche Reagenzientitration erfordern wie Studien zur Virusinaktivierung mithilfe eines geringen pH-Werts, müssen die kritischen Variablen dennoch beachtet werden. Wie bei Studien zur Virusinaktivierung mittels geringem pH-Wert werden Studien zum Solvent/Detergent-Verfahren normalerweise vollständig manuell durchgeführt. Die Dosierung der Reagenzien und die Kontrolle sind auf ähnliche Weise von der Genauigkeit und Präzision der qualifizierten Mitarbeiter abhängig, die mehrere wichtige Aufgaben gleichzeitig ausführen. Studien zur Virusinaktivierung mittels Solvent/Detergent-Verfahren unterliegen natürlichen Abweichungen, Ungenauigkeiten und Herausforderungen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit.

Bei Methoden zur Virusinaktivierung mittels Solvent/Detergent-Verfahren muss grundsätzlich ein zusätzlicher Punkt beachtet werden, der bei Methoden mittels geringen pH-Werten vernachlässigt werden kann. Jegliche hinzugegebenen Löse- oder Reinigungsmittel müssen aus dem Arzneimittel oder der Immunoglobulinlösung entfernt und mithilfe einer geeigneten Analysemethode überprüft werden. Normalerweise werden Lösemittel oder Reinigungsmittel entweder mittels Chromatographie oder mithilfe eines Pufferaustauschs durch Tangentialflussfiltration entfernt. Das Entfernen zugeführter Lösemittel oder Reinigungsmittel hat einen ähnlichen Zweck wie die pH-Wert-Rücktitration aus einer Inaktivierung mit niedrigem pH-Wert zurück in einen geeigneten physiologischen oder leicht basischen Bereich. Im Prozessmassstab würden Pufferaustausch oder chromatographische Verfahren wahrscheinlich kontinuierlich oder semi-kontinuierlich ablaufen während das Material aus einem Behälter durch eine Säule oder eine andere geeignete Membran für den Lösemittel- oder Pufferaustausch geleitet wird. Bei der Prozessentwicklung erfolgt die Virusinaktivierung mithilfe von Löse- oder Reinigungsmitteln eher separat und getrennt vom sich anschliessenden Reinigungs- oder Entfernungsschritt. Auf diese Weise kann ein kontinuierlicher Daten- bzw. Informationsfluss gewährleistet werden.

Verschiedene Impfstoffe durchlaufen eine Virusinaktivierung, darunter Toxoid-, rekombinante Protein-, Untereinheit-, Polysaccharid- und sogar einige Impfstoffe auf Basis virusähnlicher Partikel. Auch hier ist die Wahl einer geeigneten Virusinaktivierungsmethode entscheidend für die Eigenschaften des biotherapeutischen Produkts und für die Bandbreite der Viren, die wirksam unschädlich gemacht werden müssen.

Unbedingt zu berücksichtigen sind auch alternative Methoden oder Praktiken zur Vermeidung der Verunreinigung mit Fremdviren für Impfstofftypen wie Lebendviren, bei denen das biotherapeutische Produkt ein Viruspartikel ist. Zu den spezifischen Methoden für solche Produkte gehören ein oder mehrere Nanofiltrations- oder chromatographische Prozesse für die Verringerung der Belastung durch Fremdviren im jeweiligen Rohstoff. Inaktivierte oder zerstörte Viren können dennoch einer geeigneten Virusinaktivierung durch niedrigen pH-Wert oder das Solvent/Detergent-Verfahren unterzogen werden. Hierdurch wird der gewünschte immunostimulatorische Effekt auch dann bewahrt, wenn das Virusprodukt denaturiert oder anderweitig beschädigt ist.

Für Oligonukleotidprodukte oder Molekültypen wird eine Virusinaktivierung in der Regel als nicht notwendig eingestuft. Dies ist hauptsächlich auf die Eigenschaften der Reagenzien, die Reaktionsbedingungen und die Verarbeitungsmethoden zurückzuführen, die für Viren gleichermassen schädlich sind. Heutzutage werden viele dieser Oligonukleotidprodukte in der Entwicklung und Produktion zunächst aufgereinigt, konzentriert und rezeptiert. Dies erfolgt durch mehrere Pufferaustauschprozesse mittels Tangentialflussfiltration oder durch eine der verschiedenen Arten der chromatographischen Trennung.

Da ein hoher Bedarf an Datenkontinuität und elektronischen Aufzeichnungen zu den Chargen besteht, fungieren Reaktoren für die chemische Synthese als Kraftverstärker in Virusinaktivierungsprozessen. Diese Wirkung wird einerseits durch die Konzipierung und die Ausführung der Experimente und andererseits durch optimierte Datenerfassung und -integrität erzielt. Die orthogonale Prozessanalysetechnologie (PAT) dient zur Verbindung mehrerer Anwendungen und Arbeitsabläufe (z. B. die Virusinaktivierung mit Pufferaustausch) sowie zur genaueren Modellierung von Prozessabläufen in Grossbetrieben.

Sehen Sie sich eine Live eDemo zu einem beliebigen Zeitpunkt an Ihrem Arbeitsplatz oder im Home Office an.

• Unbeaufsichtigte Prozessausführung: Die iC-Software reagiert dynamisch auf die Bedingungen im Reaktor. Führen Sie Vorgänge innerhalb der Grenzwerte des Protokolls zur Virusinaktivierung konsistent aus.
• Erfassen Sie Daten von mehreren Sensoren, darunter pH-Wert, Leitfähigkeit, Redoxpotential und gelöster Sauerstoff.
• Integrieren Sie Peripheriegeräte wie Pumpen oder Waagen für den gravimetrischen Massentransfer.

Die In-situ-FTIR- und -Raman-Spektroskopie überwachen kritische Bioprozesskomponenten in vorgeschalteten und nachgeschalteten Vorgängen sowie in Konjugations- und Rezeptierungsprozessen.

Glukose und wichtige Stoffwechselprodukte können in vorgelagerten Anwendungen überwacht werden. In nachgelagerten Prozessen hingegen können die Protein- oder Impfstoffkonzentration, Stabilisatoren, Trägerstoffe und Verunreinigungen allesamt in Echtzeit überwacht und gesteuert werden – ohne die Verzögerungen oder Kosten einer Offline-Analyse.

Auf diese Weise können Prozessendpunkte schneller bestimmt und die Auswirkungen verschiedener Prozessparameter auf Produktqualität und Prozesseffizienz besser nachvollzogen werden.