Inativação Viral em Bioprocessamento

A inativação viral é a primeira de geralmente duas etapas dedicadas projetadas para aumentar a segurança de produtos bioterapêuticos. Durante a inativação, qualquer vírus presente na suspensão terapêutica agrupada e semipurificada é intencionalmente destruído ou abruptamente transformado em não patogênico, geralmente pela alteração do ambiente ao seu redor para causar a destruição e desnaturação irreversíveis da estrutura viral.

Normalmente, isto é feito pela alteração do ambiente em torno do vírus para causar a destruição e desnaturação irreversíveis da estrutura viral  — por ex., através de métodos químicos, físicos ou mesmo energéticos. A remoção do vírus é separada e diferente da inativação viral, já que se trata de um processo complementar que aumenta ainda mais a segurança viral eliminando ou separando o vírus da(s) proteína(s) ou produtos de interesse.

Muitos produtos bioterapêuticos contêm ou podem se contaminar com vírus durante a produção ou o processamento. A patogenicidade e carga viral ou quantidade de vírus nestas modalidades precisam ser eliminadas por meio de inativação e remoção para evitar que o paciente seja prejudicado; geralmente, o uso de apenas um dos dois processos não é suficiente. Muitos métodos de inativação e remoção viral estão disponíveis de acordo com as características específicas do vírus e o tipo de produto bioterapêutico. Muitos fluxos de trabalho de processamento bioterapêutico usam uma combinação de métodos complementares para aumentar o espectro dos vírus que podem ser eliminados de maneira satisfatória.

Inativação
Muitos métodos de inativação viral estão disponíveis. Os mais comuns são:

• Métodos baseados em pH baixo — especialmente para produtos bioterapêuticos como anticorpos monoclonais (mAbs)
• Métodos baseados em solventes ou surfactantes — geralmente para polissacarídeos

Métodos de inativação viral usados com menos frequência incluem pasteurização, calor seco e calor de vapor — em particular para produtos à base de sangue ou soro.

Remoção do Vírus
Métodos bem documentados de remoção de vírus incluem precipitação, cromatografia e nanofiltração.

A seleção dos métodos a serem utilizados para a inativação e remoção viral depende do tamanho, tipo e labilidade do produto bioterapêutico sendo preparado, do(s) método(s) de purificação que o fabricante deseja usar e da natureza e fator dos vírus em questão. A estrutura e função de Substâncias Medicamentosas (DS) são atributos de qualidade igualmente importantes, juntamente com a segurança viral, e devem ser avaliados e mantidos em todo o período. Qualquer método de inativação viral, pH baixo ou surfactante, beneficia-se do controle preciso e simultâneo de múltiplos Parâmetros Críticos de Processo (CPPs); um recurso necessário para entender de fato o processo em si e o efeito sobre a Substância Medicamentosa (DS). Os reatores de síntese química permitem o mapeamento de um processo moderno e uma operação consistente em um espaço de parâmetro definido, ao mesmo tempo em que servem de exemplo para a transferência de métodos e aumento de escala.

A inativação viral por pH baixo de produtos bioterapêuticos é conhecida por ter como base pH, tempo, temperatura, teor de proteínas e teor de soluto ou buffer. Muitos vírus são desnaturados de maneira irreversível e totalmente destruídos a um pH de 5,0–5,5. Dependendo do escopo dos vírus a serem inativados e removidos, essa faixa pode ser suficiente. No entanto, diversos vírus encapsulados são totalmente inativados apenas na faixa de pH de 3,5–4.

Muitos produtos bioterapêuticos mAb requerem especificamente um amplo espectro de remoção de vários tipos de vírus, de tal forma que uma meta de pH "baixo" de 3,5–4 é usada com frequência (figura A). No entanto, a exposição prolongada a essa faixa de pH pode danificar ou inativar também alguns produtos bioterapêuticos, em especial proteínas ou enzimas como proteínas sanguíneas, insulina e outras (figura B). Com a exposição prolongada ao estresse de pH, proteínas e enzimas estão sujeitas a desamidação, desnaturação e agregação significativas. As soluções de imunoglobulina (incluindo mAbs igG e igM) geralmente são menos suscetíveis do que outras proteínas ou enzimas a um pH de 3,5–5,5, embora permaneçam suscetíveis a vários graus. Após tempo suficiente em condições de inativação viral, a carga viral infecciosa deve ser totalmente minimizada. No entanto, partículas virais residuais, detritos ou outros teores ainda não terão sido removidos fisicamente (figura C).

Para produtos de imunoglobulina mAb, o pH baixo é o método mais usado para a inativação viral por ser relativamente simples, deixar poucos vestígios e normalmente requerer pouca intervenção ou etapas adicionais para a remoção, ao contrário de surfactantes e outros solventes. No entanto, as condições apropriadas e ideais variam entre as moléculas, bem como o espectro necessário de remoção viral. Portanto, devem ser realizados estudos para cada molécula para caracterizar e validar o espaço de projeto ou os limites operacionais nos quais a inativação viral completa pode ocorrer. Esses limites e o resultado de um processo de inativação viral são tipicamente definidos por todas, ou pelo menos uma seleção, das variáveis ou Parâmetros Críticos de Processo (CPPs) que influenciam o resultado da inativação viral e, portanto, a qualidade da Substância Medicamentosa (DS). A identificação e o controle desses fatores afetarão a qualidade e a quantidade do produto de maneira positiva.

Em geral, os estudos de inativação viral por pH baixo são realizados com um volume e concentração definidos da solução de imunoglobulina em um recipiente como um béquer com agitação magnética. Como a maior parte do material do estudo utilizará soluções de imunoglobulina com pH inicial próximo ao de condições fisiológicas, os estudos de inativação viral buscarão elucidar os parâmetros de adição de reagentes. Normalmente, uma titulação manual é realizada utilizando-se uma bureta ou pipetagem durante o registro intermitente da medição do pH. Após a conclusão do tempo predefinido e outros parâmetros em condições de pH baixo suficientes para inativar o teor do vírus alvo, a Substância Medicamentosa (DS) ou solução de imunoglobulina será titulada em reversão da faixa de pH baixo até uma faixa apropriada fisiológica ou ligeiramente básica. Isto serve como conclusão da inativação viral pela manutenção do pH baixo. Ainda assim, durante o estudo de titulação de pH baixo para inativação viral, a extração de amostra é necessária para análise off-line, a fim de documentar vários atributos de qualidade, como agregação ou desamidação através de métodos como a Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC). Embora cientistas qualificados consigam ter precisão, o processo de inativação viral geralmente é difícil e apresenta dificuldades relativas às variações naturais, imprecisões e desafios de reprodutibilidade de qualquer processo manual.

Enquanto a principal necessidade por estudos de inativação viral por pH baixo em bioprocessamento a jusante é definir o escopo da adição de reagentes e o tempo necessário para o processo, a caracterização da cinética do processo e o impacto dos parâmetros do processo de composição também é importante e, em última instância, um requisito para garantir o projeto de um processo de inativação viral que seja consistente e otimizado. No entanto, o monitoramento e controle de temperatura é muitas vezes um parâmetro negligenciado e, portanto, não controlado durante estudos de desenvolvimento de processos para inativação viral.

Esse descuido pode ser devido, em parte, ao uso de sistemas de escala de produção piloto ou mesmo comercial que realizam a inativação viral em recipientes de retenção ou transferência que registram a temperatura, mas não a controlam. A representatividade da escala, em particular a representatividade da mistura, é muitas vezes outro parâmetro facilmente negligenciado em estudos de inativação viral de pH baixo, como os realizados através de plataformas manuais controladas por placas de agitação magnética. A ausência do registro de dados para algo tão simples como a mistura faz com que seja impossível verificar se as condições deduzidas no estudo estavam corretas e consistentes. 

O tratamento com pH baixo para a operação unitária de inativação viral apresenta um possível risco à agregação de produtos no processo durante o processamento a jusante de um anticorpo monoclonal. Apresentado por Hiren D. Ardeshna da GlaxoSmithKline, este trabalho aborda um projeto experimental totalmente fatorial para investigar o efeito de quatro parâmetros de processo:

• Ponto Final de pH Baixo
• Tempo de Manutenção de pH Baixo
• Duração da Titulação de pH Baixo
• Duração da Titulação de Neutralização

Métodos de inativação viral por solvente ou detergente são geralmente empregados contra vírus encapsulados. Os reagentes utilizados geralmente têm um impacto insignificante na labilidade da proteína terapêutica ou anticorpos que estão sujeitos aos desafios de desnaturação ou desamidação possível com alguns métodos por pH baixo. Os métodos de tratamento de solventes ou detergentes para inativação viral têm muitas das mesmas necessidades e fatores dos métodos por pH baixo, principalmente para definir o escopo da adição de reagentes (neste caso, um solvente ou detergente) e o tempo necessário para o processo. Assim como na inativação viral por pH baixo, as condições variam entre imunoglobulinas ou outros tipos de Substância Medicamentosa (DS). Portanto, devem ser realizados estudos para cada molécula para caracterizar e validar o espaço de projeto ou os limites operacionais nos quais a inativação viral completa por solvente ou detergente pode ocorrer. Esses limites e o resultado de um processo de inativação viral são definidos da mesma forma por Parâmetros Críticos de Processo (CPPs), incluindo temperatura, teor de proteína, teor de solvente ou detergente, tempo em condições de inativação, bem como mistura e eficácia da homogeneização de solventes ou detergentes. A identificação e o controle desses fatores afetarão a qualidade e a quantidade do produto de maneira positiva.

Embora os estudos de inativação viral por detergente não exijam a mesma forma de titulação de reagentes que estudos de pH baixo, um espaço de projeto de variáveis críticas ainda precisa ser avaliado. Assim como em pH baixo, estudos de inativação viral em que se utilizam solventes ou detergentes tradicionalmente caracterizam o processo como inteiramente manual. A dosagem e os controles de reagente são igualmente dependentes da exatidão e precisão de pessoas altamente qualificadas que realizam simultaneamente múltiplas tarefas críticas. Estudos de inativação viral por solvente ou detergente estão sujeitos a variações naturais, imprecisões e desafios de reprodutibilidade.

Métodos de inativação viral que dependem de solventes ou detergentes geralmente requerem um outro ponto de consideração não tipicamente pertinente aos métodos de baixo pH. Quaisquer solventes ou detergentes adicionados devem ser removidos da Substância Medicamentosa (DS) ou solução de imunoglobulina e verificados por um método analítico adequado. Normalmente, solventes ou detergentes são removidos através de cromatografia ou troca de buffer via filtração de fluxo tangencial. A remoção de solventes ou detergentes adicionados é um tanto análoga ao propósito de titulação de pH reverso de uma inativação por baixo pH de volta para dentro de uma faixa fisiológica ou ligeiramente básica apropriada. Em escala, a troca de buffer ou métodos cromatográficos provavelmente ocorreriam como operações unitárias contínuas ou semicontínuas à medida que o material se move de um recipiente de retenção através de uma coluna ou outra membrana apropriada para troca de solventes ou buffer. No desenvolvimento do processo, a inativação viral por solvente ou detergente provavelmente ocorrerá de maneira separada e distinta da etapa seguinte de purificação ou remoção. Como tal, a continuidade de dados ou informações pode ser agravada por essa prática.

Vários produtos vacinais sofrem inativação viral, incluindo toxoide, proteína recombinante, subunidade, polissacarídeo e até mesmo algumas poucas vacinas de partículas semelhantes a vírus. Mais uma vez, a seleção de um método de inativação viral adequado considerará a natureza do produto bioterapêutico, bem como a amplitude dos vírus que precisam ser efetivamente eliminados.

Geralmente, é preciso considerar métodos ou práticas alternativas que previnem a contaminação viral extrínseca para tipos de vacinas, como vírus atenuados vivos — onde o produto bioterapêutico é uma partícula viral. Metodologias específicas para esses produtos podem incluir um ou mais processos de nanofiltração ou cromatográficos para uma efetiva redução da carga viral extrínseca nas respectivas fontes de matéria-prima. Vírus inativados ou destruídos ainda podem sofrer um processo de inativação viral à base de baixo pH ou por solvente ou detergente adequado — pois isso ainda pode manter o efeito imunoestimulante desejado mesmo que o produto viral seja desnaturado ou interrompido de outra forma.

Os métodos de inativação viral para produtos de oligonucleotídeos ou tipos de moléculas não são extensivamente considerados necessários. Isso se deve principalmente à natureza dos reagentes, condições de reação e métodos de processamento que são consistentemente desfavoráveis aos vírus. Atualmente, muitos desses produtos de oligonucleotídeos em desenvolvimento e produção são primariamente purificados, concentrados e formulados por várias trocas de buffer via filtração de fluxo tangencial ou por um dos vários tipos de separação cromatográfica.

Com a necessidade de continuidade de dados e registros eletrônicos de lotes, os reatores de síntese química funcionam como um multiplicador de força em processos de inativação viral, tanto por projeto e execução de experimentos, quanto pela facilitação da captura e integridade dos dados. A Tecnologia Analítica de Processo (PAT) Ortogonal conecta múltiplas aplicações e fluxos de trabalho, como a inativação viral com troca de buffer e modelam com mais precisão os fluxos de processos de operações em larga escala.

Visualize a eDemo ao vivo de seu trabalho ou home office de acordo com sua programação.

• Pressione Play e fique tranquilo; o software iC responde dinamicamente às condições dentro do reator. Execute operações consistentes dentro dos limites do protocolo de inativação viral.
• Capture dados de múltiplos sensores, incluindo pH, condutividade, potencial de redox oxidativo (ORP) e oxigênio dissolvido.
• Integre unidades periféricas, como bombas ou balanças para transferência de massa gravimétrica.

A Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier e Raman in-situ rastreiam componentes críticos de bioprocesso ao longo das operações unitárias a montante, a jusante, de conjugação e de formulação.

A glicose e os principais metabólitos podem ser monitorados em aplicações a montante, enquanto nos processos a jusante proteína ou concentração de vacinas, estabilizadores, excipientes e impurezas podem ser monitorados e controlados em tempo real sem o retardo ou o custo associado à análise off-line.

Isso permite a rápida determinação dos pontos finais do processo, bem como, a compreensão clara do impacto de vários parâmetros de processo na qualidade do produto e na eficiência do processo.