Инактивация вирусов в биотехнологических процессах

Инактивация вирусов — первый из двух стандартных этапов повышения безопасности биотерапевтической продукции. Во время инактивации все вирусы в частично очищенной терапевтической суспензии либо намеренно уничтожаются, либо лишаются своих патогенных свойств в течение короткого времени. Для необратимого разрушения и денатурации вируса обычно необходимо изменить окружающую его среду.

Обычно для необратимого разрушения и денатурации структуры вируса в окружающую его среду вносятся изменения  — с помощью химических, физических или даже энергетических методов. Удаление вирусов — отдельный процесс, дополняющий инактивацию. Вывод или отделение вируса от белка (белков) или производимого продукта способствует дальнейшему повышению вирусной безопасности.

Многие биотерапевтические продукты содержат вирусы или подвергаются вирусному загрязнению в ходе производства или обработки. Для нейтрализации патогенности, устранения вирусной нагрузки (количества вируса) и исключения вреда для пациента эти препараты подвергают специальной очистке, включающей два этапа — инактивацию и удаление вирусов. Обычно применение этих процессов по отдельности недостаточно эффективно. Существуют различные методы инактивации и удаления, учитывающие специфические характеристики вируса и вид биотерапевтического продукта. Для расширения спектра уничтожаемых вирусов во многих процессах биотерапевтической обработки применяется сочетание взаимодополняющих методов.

Инактивация
Существует несколько методов вирусной инактивации. Наиболее распространенные из них:

• методы с применением низкого уровня pH — особенно часто применяются к таким биотерапевтическим продуктам, как моноклональные антитела (mAbs)
• методы с применением растворителя или ПАВ — обычно используются для полисахаридов

Реже используются такие методы инактивации вирусов, как пастеризация, обработка сухим теплом и применение парообразного теплоносителя (например, для продуктов на основе крови или сыворотки).

Удаление вирусов
Осаждение, хроматография и нанофильтрация широко освещены в литературе.

Выбор метода инактивации и удаления вирусов зависит от размера, вида и лабильности биотерапевтического продукта, метода (методов) очистки при производстве, происхождения и титра вирусов. Наряду с вирусной безопасностью важными показателями качества, которые необходимо контролировать в ходе всего процесса, являются структура и действие лекарственного вещества. Эффективность любого метода инактивации (с применением низкого уровня pH или ПАВ) обеспечивается точным контролем одновременно нескольких критических параметров процесса. Такой контроль необходим для всестороннего понимания процесса и его воздействия на лекарственное вещество. Современные рабочие станции химического синтеза поддерживают картирование процессов, стабильную работу в рамках заданных параметров, а также моделирование для переноса и масштабирования метода.

На процесс инактивации вирусов с применением низкого уровня pH влияют такие характеристики, как pH, длительность, температура, содержание белка и растворителя или буфера. Необратимая денатурация и эффективное уничтожение многих вирусов возможны при уровне pH 5,0–5,5. В зависимости от объема вирусов, которые подвергаются инактивации и очистке, этого диапазона может оказаться достаточно. Однако для эффективной инактивации ряда вирусов в оболочке необходим уровень pH в диапазоне 3,5–4.

Многие биотерапевтические продукты типа mAb требуют более обширной очистки от различных вирусов. Для них целевым «низким» уровнем pH будет 3,5–4 (рис. A). Однако при длительном воздействии pH в этом диапазоне также может произойти инактивация или повреждение некоторых биотерапевтических продуктов, в частности белков или ферментов — например, белков крови, инсулина и др. (рис. B). При продолжительном воздействии низкого pH на белки и ферменты наблюдается значительное дезамидирование, денатурация и агрегация. По сравнению с другими белками или ферментами иммуноглобулины (включая моноклональные антитела IgG и IgM) обычно менее восприимчивы к pH 3,5–5,5 — хотя эта восприимчивость сохраняется у них в той или иной степени. Инфекционная вирусная нагрузка снижается до эффективного минимума при выдерживании в условиях инактивации в течение достаточно длительного времени. Однако частицы вирусов, органические и другие остатки необходимо будет удалить физическим способом (рис. C).

Для инактивации вирусов в иммуноглобулиновых продуктах типа mAb чаще всего применяется метод с низким уровнем pH, так как он достаточно прост, компактен и, в отличие от ПАВ или растворителей, практически не требует участия оператора и дополнительных шагов по удалению. Однако подходящие и оптимальные условия инактивации зависят от самой молекулы и требуемого спектра удаления вирусов. По этой причине для установления и проверки проектного поля или рабочих границ эффективной вирусной инактивации необходимы исследования молекул. Эти границы и результат процесса инактивации вирусов обычно определяются полным или частичным набором переменных — критическими параметрами процесса. Они влияют на исход вирусной инактивации и, следовательно, на качество лекарственного вещества. Выявление и учет этих факторов положительно скажется на качественных и количественных характеристиках продукта.

Обычно для исследований по вирусной инактивации с применением низкого уровня pH используется раствор иммуноглобулина заданного объема и концентрации, который помещается в емкость — например, лабораторный стакан с магнитной мешалкой. Чаще всего в качестве материала исследования выступают иммуноглобулины, у которых начальный pH близок к физиологическим условиям. Задача исследователей — определить параметры добавления реагентов. Для этого проводится ручное титрование с бюреткой или пипеткой с периодической регистрацией значений pH. После выдерживания в условиях низкого уровня pH с соблюдением других параметров в течение времени, рекомендованного для инактивации целевых вирусов, лекарственное вещество или раствор иммуноглобулина подвергают обратному титрованию. Уровень pH при этом изменяется от низкого до физиологического или слабо-щелочного. Это конечный этап вирусной инактивации с помощью выдерживания при низком уровне pH. Однако в ходе такого исследования с применением титрования при низком уровне pH для анализа в лаборатории и регистрации различных качественных характеристик (например, оценки агрегации или дезамидирования методом эксклюзионной хроматографии по размеру) требуется отбор проб. Хотя опытные ученые выполняют все процедуры с нужной точностью, инактивация вирусов — кропотливый ручной процесс, сопряженный с естественными изменениями и отклонениями, которые затрудняют получение воспроизводимых результатов.

Хотя главной целью изучения вирусной инактивации при низком уровне pH на последующих этапах биотехнологического процесса является определение объема добавляемых реагентов и длительности выдерживания, не менее важно определение кинетики процесса и влияния его комбинированных параметров. В конечном итоге эти характеристики необходимы для разработки надежного и оптимального процесса инактивации. Тем не менее в ходе такой разработки ученые часто не отслеживают температуру — она остается неконтролируемым параметром.

Причиной может быть использование для вирусной инактивации выдерживанием экспериментальных или даже коммерческих систем промышленного типа либо передаточных емкостей, которые регистрируют температуру, но не регулируют ее. Еще один параметр, который часто не учитывается исследователями инактивации при низком уровне pH, которые проводят опыты на ручных платформах с магнитными мешалками, — репрезентативность масштаба, в частности репрезентативность перемешивания. Без сбора данных о такой простой процедуре невозможно подтвердить правильность и стабильность заданных условий исследования. 

Вирусная инактивация с применением низкого уровня pH на последующих этапах обработки создает риск агрегации в продукте с моноклональными антителами. В презентации Хирен Д. Ардешна (Hiren D. Ardeshna) из компании GlaxoSmithKline представлена многофакторная экспериментальная схема, которая позволяет исследовать влияние четырех параметров процесса:

• конечная точка низкого уровня pH
• время выдерживания при низком уровне pH
• длительность титрования с низким уровнем pH
• длительность титрования с нейтрализацией

Методы с растворителем или ПАВ чаще всего используются для инактивации вирусов в оболочке. Применяемые реагенты оказывают незначительное влияние на лабильность терапевтических белков или антител, тогда как некоторые методы с применением низкого pH могут вызывать денатурацию или дезамидирование. Многие требования к вирусной инактивации с растворителем или ПАВ аналогичны требованиям к методам с низким уровнем pH — в первую очередь необходимо определить объем добавляемого реагента (в данном случае растворителя или ПАВ) и длительность процесса. Как и в случае с инактивацией при низком pH, конкретные условия зависят от вида иммуноглобулина или лекарственного вещества. По этой причине для установления и проверки проектного поля или рабочих границ эффективной вирусной инактивации с растворителем или ПАВ необходимы исследования молекул. Эти границы и результат процесса инактивации аналогично определяются критическими параметрами процесса. К ним относятся температура, содержание белка, содержание растворителя или ПАВ, время выдерживания в условиях инактивации, а также перемешивание и эффективность гомогенизации растворителя или ПАВ. Выявление и учет этих факторов положительно скажется на качественных и количественных характеристиках продукта.

Хотя в исследованиях вирусной инактивации с применением ПАВ не требуется такого же титрования реагента, как в методах с низким уровнем pH, оценка проектного поля с критически важными переменными остается обязательным условием. Как и в случае с низким pH, определение характеристик инактивации вирусов растворителем или ПАВ обычно полностью осуществляется вручную. Дозирование реагентов и управление экспериментом также зависят от точности действий квалифицированных специалистов, которые одновременно выполняют несколько критически важных заданий. По этой причине исследования вирусной инактивации с применением растворителя или ПАВ также сопряжены с естественными изменениями, отклонениями и трудностями обеспечения воспроизводимости.

При использовании методов инактивации с растворителем или ПАВ по существу необходимо учесть еще один аспект, не свойственный для методов с низким уровнем pH. Все добавленные растворители или ПАВ в обязательном порядке должны быть удалены из лекарственного вещества или раствора иммуноглобулина. Их вывод подтверждается с помощью подходящего метода анализа. Обычно для удаления растворителя или ПАВ используется хроматография или замена буфера путем тангенциальной поточной фильтрации. Цель вывода добавленных реагентов или ПАВ в некотором смысле аналогична цели обратного pH-титрования от низкого pH для инактивации до физиологических или слабо-щелочных показателей. В масштабе буферные или хроматографические методы чаще всего имеют вид непрерывных или полунепрерывных типовых операций, в рамках которых материал направляется из емкости для выдержки через колонку или другую подходящую мембрану для замены растворителя или буфера. При этом при разработке процесса этап инактивации вирусов растворителем или ПАВ чаще всего отделен от последующего очищения или удаления. Такая практика может усложнять обеспечение непрерывности данных или информации.

Вирусной инактивации подвергаются различные вакцины, включая токсоидные, на основе рекомбинантного белка, субъединичные и полисахаридные вакцины и даже некоторые вакцины с вирусоподобными частицами. Как указывалось ранее, при выборе метода учитывается характер биотерапевтического продукта и спектр вирусов, которые необходимо эффективно вывести.

Как правило, для обработки живых ослабленных вакцин с вирусными частицами (где биотерапевтический продукт представляет собой вирусную частицу) рекомендуется использовать альтернативные методы или процедуры, предотвращающие внешнее вирусное заражение. Специальные методики для таких продуктов могут включать один или несколько процессов нанофильтрации или хроматографии. Эти этапы необходимы для эффективного уменьшения внешней вирусной нагрузки соответствующих сырьевых материалов. Инактивированные или разрушенные вирусы иногда подвергаются дальнейшей обработке низким уровнем pH или растворителем/ПАВ, так как желаемый иммуностимулирующий эффект продукта может сохраняться и после денатурации или других изменений.

Вирусная инактивация олигонуклеотидных продуктов или молекулярных действующих веществ не считается необходимой. Главная причина заключается в том, что свойства реагентов, условия реакции и методы обработки создают неблагоприятную для вирусов среду. В настоящее время для очистки, концентрирования и составления рецептур многих разрабатываемых и производимых олигонуклеотидных продуктов используются различные методы хроматографического выделения или замена буфера путем тангенциальной поточной фильтрации.

С учетом потребностей в непрерывности информации и ведении электронных записей рабочие станции химического синтеза повышают эффективность процессов инактивации вирусов не только с точки зрения планирования и проведения экспериментов, но и благодаря сбору данных и обеспечению их целостности. Независимая процессно-аналитическая технология (PAT) объединяет множество задач и рабочих процессов, включая вирусную инактивацию с заменой буфера, и способствует более точному моделированию крупномасштабных процедур.

Посмотрите онлайн-демонстрацию оборудования в любое удобное время.

• Достаточно активировать устройство: программное обеспечение iC реагирует на изменение условий в реакторе автоматически. Операции в рамках протокола вирусной инактивации выполняются без ошибок и перебоев.
• Можно получить различные типы данных, в том числе показатели pH, УЭП, окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) и содержания растворенного кислорода.
• Возможность подключить периферийные устройства — например, насосы или весы для гравиметрического переноса массы.

ИК-Фурье и рамановская спектроскопия in-situ позволяют отслеживать критически важные компоненты на всех этапах биотехнологического процесса, в том числе в ходе конъюгации и составления рецептур.

На начальных стадиях возможен мониторинг содержания глюкозы и ключевых метаболитов, на завершающих — мониторинг и контроль концентрации белка или вакцины, стабилизаторов, вспомогательных веществ и примесей в режиме реального времени без задержек и затрат на пробоподготовку.

Это позволяет быстро определить конечные точки процесса, а также четко установить влияние различных параметров на качество продукта и эффективность процесса.