Cristalización de proteínas

La cristalización de proteínas es el acto y método de creación de estructuras reticulares ordenadas para macromoléculas complejas. Normalmente, las proteínas son propensas a la desnaturalización y amorfas cuando se encuentran en estado sólido, mientras que las proteínas existentes en estructuras reticulares cristalinas resisten la desnaturalización y poseen una mayor estabilidad. Las proteínas pueden cristalizarse si se encuentran en entornos adecuados. La cristalización de proteínas se considera tanto un arte como una ciencia. Esto se debe a las interacciones de variables de gran complejidad que afectan al proceso de cristalización de proteínas.

Los cristales de proteínas se suelen crear principalmente con el objetivo de contribuir a las investigaciones de biología estructural, en general, mediante la cristalografía de difracción de rayos X. Los investigadores pueden visualizar áreas en el marco que permiten la interacción con otras moléculas comprendiendo las estructuras tridimensionales de las proteínas (por ejemplo, para conocer mejor cómo interactúan las enzimas, los sustratos y los ligandos). Además, la cristalización es un método eficaz para crear proteínas puras que no estén contaminadas por otras proteínas o por materia biológica externa. De esta manera, ofrece un medio de purificación y separación alternativo a la cromatografía preparativa. 

Las proteínas han ido adquiriendo importancia como medicamentos terapéuticos. Sin embargo, producir proteínas con la estabilidad necesaria conlleva algunos retos clave, entre los que se incluyen la variación del producto, la pérdida de estructura que reduciría la eficacia y la formación de productos secundarios potencialmente peligrosos. La cristalización de proteínas es un método para producir formatos de dosificación puros, estables y sólidos, y varios tratamientos inyectados e infusionados asociados a los cristales de proteínas. Antes, la cristalización de proteínas era una práctica de laboratorio que contribuía a la cristalografía de rayos X. Sin embargo, debido al crecimiento exponencial de los tratamientos a base de proteínas, ahora es un área en la que debemos centrarnos y es cada vez más importante escalar las cristalizaciones de proteínas a niveles de producción.

El escalado de la cristalización de proteínas se asemeja al de la cristalización de moléculas pequeñas en cuanto a los requisitos para optimizar los parámetros esenciales del proceso (CPP) en el laboratorio para conseguir los atributos de calidad fundamentales (CQA) de una sustancia medicamentosa cristalizada a escala comercial. Normalmente, una plataforma holística para el desarrollo y escalado del proceso de cristalización de proteínas incluye:

• Caracterización de sistemas de partículas in situ
• Control espectroscópico y caracterización de polimorfos
• Optimización del procedimiento y de las estrategias del control de retroalimentación a través de módulos y sensores integrados

Existen importantes aplicaciones farmacéuticas asociadas a la cristalización de proteínas: la química médica mediante biología estructural, el desarrollo, el escalado, la separación y la purificación de fármacos a base de proteínas, y la formulación y la administración de fármacos.

• Química médica mediante biología estructural. Los avances en las técnicas de cristalización de proteínas y la cristalografía de rayos X mejorada han conducido a la deducción de decenas de miles de estructuras proteicas tridimensionales. Es posible comprender las interacciones fármaco-receptor en detalle determinando la estructura de estas macromoléculas complejas y visualizando los puntos de unión. Con esta información, podrá tener una mejor noción a nivel molecular sobre los inhibidores de proteína, los activadores alostéricos, los cofactores e, incluso, sobre los sitios catalíticos de enzimas o “sitios activos”, lo que da como resultado unos mejores fármacos con eficacia mejorada. Los grandes avances en el desarrollo de proteasas de VIH son uno de los ejemplos clásicos sobre la importancia de comprender la estructura inhibidora de proteínas mediante la cristalografía.
• Desarrollo, escalado, separación y purificación de los tratamientos a base de proteínas. Además del aumento en cristales de proteínas únicos para la cristalografía de rayos X, la industria farmacéutica ha incrementado sus esfuerzos en el desarrollo de tratamientos basados en cristales de proteínas. El objetivo de estas aplicaciones es desarrollar y escalar grandes cantidades de cristales de proteínas estables y puros que tengan el tamaño de partículas adecuado y la distribución de dicho tamaño de partículas bien controlada. En relación con la cromatografía preparativa, la cristalización de proteínas tiene el potencial de ser un medio alternativo y rentable para la separación y purificación de macromoléculas y el aislamiento de moléculas quirales. Las herramientas para escalar las cristalizaciones de proteínas son similares a las que se usan para escalar las reacciones químicas con la necesidad de comprender los CPP y su efecto en los CQA.
• Formulación y administración de fármacos. Los tratamientos de proteínas se administran como soluciones y mediante inyecciones o infusiones. Como se deben administrar grandes cantidades de proteína, las soluciones de proteínas infusionadas se diluyen para evitar la viscosidad y los problemas de agregación. Puede resultar menos cómodo para el paciente y el hospital debido al tiempo que se requiere para infusionar todo el tratamiento. Sin embargo, también puede contribuir a la menor conformidad del paciente con cualquier tipo de administración parenteral. El uso de la forma cristalina de las proteínas en suspensión es de gran interés, puesto que estas formulaciones presentan menos problemas de viscosidad y pueden administrarse en concentraciones más altas. Otro punto clave es que el tamaño de los cristales de proteínas debe controlarse meticulosamente para asegurar que la suspensión pueda atravesar fácilmente una aguja de inyección o de infusión. También hay que tener en cuenta que cualquier cristal residual que no se disuelva durante la reconstitución no debe exceder el tamaño de partículas esencial, ya que podría provocar unos efectos secundarios adversos debido a la acumulación de capilares en la vasculatura, con lo que se minimizan, por lo general, las cantidades esenciales de partículas >15 µm. 

1. Elija un disolvente adecuado. Entre las consideraciones más comunes se incluyen la cantidad de soluto que se puede disolver (solubilidad), lo práctico que resulta manipular el disolvente (seguridad) y cómo el disolvente afectará a la estabilidad y a las variaciones en energía libre de los péptidos y proteínas.
2. Obtenga la supersaturación. Caliente la sustancia medicamentosa soluble a base de péptidos o proteínas en el disolvente o en una solución tampón a la máxima tolerancia permitida (normalmente limitada por la desnaturalización). La solución se volverá supersaturada.
3. Cristalice el producto controlando los CPP. Reduzca la solubilidad mediante el enfriamiento, la adición de antidisolventes, la evaporación o la reacción. A medida que se reduce la solubilidad, se alcanza un punto en el que los cristales se nuclean y, a continuación, se forman. Deberán formarse unos cristales de producto de gran pureza, aunque los motivos estructurales con unos niveles altos de energía libre podrían formar estructuras alternativas o no cristalinas. Para evitarlo, hay que llevar a cabo un control de CPP minucioso.
4. Deje que el sistema alcance el equilibrio. Esto se hace para maximizar el rendimiento de los elementos sólidos de los medicamentos.
5. Filtre y seque el producto purificado.

Hay varios métodos que se emplean para generar cristales de proteínas. Entre los más comunes se encuentran la difusión de vapor y el microbatch. El primer método tiene dos variaciones, conocidas como la técnica de gota pendiente y la de gota sedente. Básicamente, ambas técnicas funcionan igual. Una gota de solución que contenga la proteína, la solución tampón y los precipitantes se equilibra en un sistema hermético con un depósito que contiene concentraciones de soluto más elevadas de la misma solución, pero sin la proteína. El agua de la gota que contiene la proteína se vaporiza y es atraída por la solución de mayor concentración en el depósito. A medida que aumenta la concentración de solutos en la gota, la proteína comienza a cristalizarse. En el método microbatch, las proteínas y otros reactivos se introducen y contienen bajo una fina capa de aceite mineral que elimina la difusión del agua. El microbatch consiste, básicamente, en un pequeño reactor que contiene todos los ingredientes necesarios en las concentraciones estables adecuadas para que pueda darse la cristalización.

Dado que encontrar el conjunto correcto de reactivos, parámetros y condiciones necesarios para cristalizar una proteína suele ser algo empírico, el método más práctico para una cristalización de proteínas adecuada consiste en usar una gama variable de condiciones experimentales que se basan en experiencias previas. La forma más sencilla de hacerlo es mediante los kits de cribado de cristales de proteínas disponibles en el mercado que contengan soluciones preenvasadas en placas de múltiples pocillos con soluciones tampón y precipitantes, entre otros. Para generar cristales con estos kits, se usa el método de difusión de vapor de gota pendiente. Cuando es necesario un cribado a mayor escala, existen sistemas de alto rendimiento disponibles que automatizan el método microbatch. De este modo, ahorran tiempo y monotonía, al tiempo que minimizan la cantidad de proteína purificada necesaria. En cuanto a las cristalizaciones de proteínas a gran escala para aplicaciones farmacéuticas e industriales, la información obtenida de los experimentos de cribado constituye la base para la aplicación de sistemas de reactores automatizados a gran escala caracterizados por una tecnología analítica de procesos en tiempo real e in situ. 

Con el objetivo de respaldar el desarrollo y la fabricación del proceso, uno de los pasos iniciales de mayor importancia para lograr una cristalización de proteínas satisfactoria es asegurar la disponibilidad de un suministro adecuado de proteínas altamente purificadas y bien caracterizadas. Además de pura (es decir, libre de contaminantes, como las impurezas propias de las matrices de fermentación), la proteína debe ser homogénea y estable (o estabilizada) en la solución con:

• Agregación mínima (figura A)
• Estructura secundaria, terciaria y cuaternaria correcta (figura B)
• Alguna modificación conjugada o recombinante (figura C)

Además, todos los reactivos y disolventes que se usan durante el proceso de cristalización de proteínas deben estar libres de contaminantes, ya que podrían afectar de forma significativa a la nucleación.

Al igual que sucede con la cristalización de moléculas pequeñas, las proteínas se cristalizan a partir de soluciones supersaturadas. En cuanto a las moléculas pequeñas que forman estructuras reticulares de cristales sólidas, manipular la temperatura es uno de los mecanismos principales para lograr la supersaturación. También es útil para las proteínas. Sin embargo, es posible trabajar con un intervalo de temperatura reducido. Esto se debe a que los cristales de proteínas suelen tener disolventes como parte de su estructura cristalina, suelen ser sensibles a la temperatura y propensos a la desnaturalización y agregación.

Las moléculas pequeñas tienen muchos menos grados de libertad estereoscópica y, por ello, se cristalizan con mayor facilidad. Los péptidos de moléculas grandes cuentan con muchas más interacciones internas ácidas, básicas, polares y no polares, y con fuerzas de repulsión que resisten la cristalización ordenada, un fenómeno que se agrava en el caso de las proteínas aún más grandes. La mayoría de los péptidos compatibles con la cristalización también contiene un número significativo de enlaces disulfuro, que son cruciales para inmovilizar los motivos estructurales. El alcance del desorden intramolecular o la posible variación en la estructura son atributos importantes a la hora de determinar si el péptido o la proteína podría cristalizarse en lugar de precipitarse. Aunque la molécula esté predispuesta con atributos aptos para la cristalización, existen varios parámetros del proceso que afectan a la viabilidad comercial del proceso y que deben caracterizarse.

Aparte de la temperatura, hay otros factores que afectan a la cristalización de proteínas o asisten en el proceso mediante la supersaturación, incluidos el ajuste del pH y la fuerza iónica de una solución, la adición de sales y precipitantes como el polietilenglicol para reducir la solubilidad, y el tipo de ligando presente, entre otros. La clave está en supersaturar la solución en un entorno que no altere el carácter normal de la proteína. Por ello, es importante encontrar un conjunto de variables y condiciones que tengan como resultado unos cristales con la morfología y pureza correctas y unas tasas de crecimiento aceptables.

La cristalización de proteínas se lleva a cabo a través de una serie de mecanismos interdependientes:

1. Nucleación
2. Crecimiento
3. Aceitado en cristalización
4. Aglomeración
5. Rotura
6. Siembra
7. Química de polimorfismo

Estos mecanismos, que a menudo no pueden percibir los científicos, desempeñan un papel dominante en la definición del resultado de un proceso de cristalización.

El desarrollo y escalado de las cristalizaciones de los tratamientos a base de proteínas requieren una comprensión detallada de las variables y las condiciones que afectan al proceso de cristalización. Al igual que sucede con otras cristalizaciones, obtener la formación del cristal con la forma, el tamaño de las partículas y la distribución del tamaño deseados requiere un control minucioso para lograr una calidad uniforme en el producto. Cualquier variación en los atributos de calidad fundamentales de las suspensiones de cristales de proteínas afectará directamente a la eficacia del tratamiento. Los cristales de proteínas son muy sensibles a su entorno de creación y pueden dañarse con facilidad por las temperaturas excesivas, la pérdida de disolventes o debido a otras tensiones externas o, incluso, al proceso de muestreo. Por ello, es recomendable medir los parámetros esenciales del proceso y la calidad del producto in situ. Es decir, sin extraer los cristales del entorno de su solución.

• Los reactores químicos automatizados EasyMax y Optimax ofrecen un control, ajuste y registro de parámetros precisos, entre los que se incluyen la temperatura, el pH, la conductividad, la velocidad de agitación y la dosificación de soluciones tampón y excipientes, que son fundamentales para un correcto desarrollo y escalado de las cristalizaciones de proteínas.
• Las herramientas de tecnología analítica in situ que ayudan con el control, la resolución de problemas y la corrección de las desviaciones del proceso también resultan muy útiles.
  • La espectroscopia Raman y la espectroscopia FTIR in situ llevan a cabo un seguimiento de las concentraciones de los reactivos, controlan la creación de estructuras cristalinas y, también, miden la concentración de las soluciones supersaturadas.
  • La tecnología ParticleTrack (con FBRM) controla el tamaño cambiante de los cristales y su distribución en tiempo real, a medida que los segmentos clave del proceso de cristalización continúan.
  • EasyViewer ofrece la visualización y el análisis de imágenes del proceso de cristalización a medida que progresa.

Cuando se usan reactores de laboratorio automatizados junto con analizadores in situ en tiempo real, se puede identificar el impacto de los distintos parámetros del proceso en los mecanismos de cristalización, como la agregación, el crecimiento, la aglomeración, la rotura y el cambio de forma. Un control preciso del proceso de cristalización junto con un control continuo e in situ del progreso de la formación de cristales permiten que la optimización y el escalado se basen en hechos y en datos.

El reactor de laboratorio automatizado EasyMax es una estación de control completa para la optimización de parámetros en la cristalización de proteínas. Sirve de refuerzo para el desarrollo, el diseño y la ejecución del escalado. Este sistema completamente automatizado ofrece un control preciso de los parámetros del proceso.

• Controla los CPP, entre los que se incluyen la velocidad de dosificación, la temperatura, la agitación, el pH y la conductividad.
• Se integra con facilidad con los instrumentos analíticos de cristalización in situ, entre los que se incluyen ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) e EasyViewer (análisis de imágenes in situ).
• El software iC permite la ejecución y el control automatizados de todos los experimentos y equipos periféricos, así como la captura de datos completa y la conservación de registros.

ReactIR usa la espectroscopia de infrarrojo medio para calcular la fase de solución en los estudios de cristalización. Las mediciones de ReactIR no se ven afectadas por sólidos en suspensión, burbujas ni por otras masas de partículas.

• Lleva a cabo un seguimiento in situ y en tiempo real de los solutos individuales de la cristalización.
• Calcula las concentraciones de la solución como apoyo a los estudios de supersaturación.
• Proporciona datos analíticos útiles para el control y la toma de decisiones en tiempo real.

ReactRaman usa la espectroscopia Raman para ofrecer análisis moleculares de las partículas en solución.

• Lleva a cabo un seguimiento de la formación, la estructura y la morfología de los cristales de manera no destructiva, in situ y en tiempo real.
• Determina los efectos de los parámetros y optimiza las condiciones de la cristalización y sus variables para llegar a los objetivos de calidad.

ParticleTrack usa la tecnología de medición de reflectancia con haz enfocado (FBRM) y es un instrumento óptico basado en sensores que se inserta directamente en un recipiente para realizar el seguimiento de los cambios en el tamaño de las partículas y el recuento de estas en tiempo real. ParticleTrack emplea mediciones de la distribución de la longitud de cuerda para obtener la distribución del tamaño de los cristales (CSD).

• Los cristales de proteínas se controlan continuamente, ya que las condiciones experimentales varían.
• Puede realizar un seguimiento de los lotes o del crecimiento continuo durante la cristalización en tiempo real sin necesidad de extraer muestras.
• Caracteriza las condiciones que afectan a la nucleación, agregación, polimorfismo y otros atributos del sistema.

EasyViewer es un instrumento basado en sensores que se inserta directamente en un recipiente para capturar imágenes de los sistemas de partículas. Realiza análisis de imágenes y calcula el recuento, la distribución del tamaño y la morfología de las partículas a partir de imágenes en línea de resolución temporal del proceso, lo que permite analizar las tendencias de las poblaciones a lo largo del tiempo.

• Los cristales de proteínas se controlan continuamente, ya que las condiciones experimentales varían.
• Puede realizar un seguimiento de los lotes o del crecimiento continuo durante la cristalización en tiempo real sin necesidad de extraer muestras.
• Visualiza los parámetros de la cristalización que afectan a la nucleación, agregación, polimorfismo y otros atributos del sistema en tiempo real.

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V. y Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12 (Control en tiempo real de la cristalización biofarmacéutica: distribución de la longitud de cuerda a la distribución del tamaño de los cristales para la lisozima, la insulina rHu y la vitamina B12). Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Los autores han informado de que han logrado desarrollar un enfoque eficiente con respecto al control en tiempo real de las cristalizaciones biofarmacéuticas. Este procedimiento emplea ParticleTrack para medir la distribución de la longitud de cuerda de una serie de moléculas biofarmacéuticas bajo condiciones estáticas y dinámicas. A continuación, aplica el modelado matemático para convertir la CLD en CSD. Las biomoléculas que se han investigado tienen distintas formas cristalinas, lo que depende de las condiciones experimentales de la cristalización. La lisozima puede producir cristales con formas tetragonales o de aguja, la insulina rHu produce cristales con formas romboidales y la B12 produce cristales con formas poliédricas.

Las autores han desarrollado modelos para determinar la CSD para la baja relación dimensional de los cristales tetragonales, romboidales y poliédricos y la alta relación dimensional de los cristales con forma de aguja. Los autores usaron tres modelos diferentes para determinar la distribución del tamaño de los cristales:

• Un modelo desarrollado por otro grupo de investigación que dedujo que los cristales podían representarse como esferas (diámetro equivalente esférico, SED) y que era efectivo para los cristales con una relación dimensional baja
• Los autores de este estudio desarrollaron un modelo que se basa en la anchura para los cristales con una relación dimensional alta
• Por último, desarrollaron un modelo basado en la longitud y requirieron que se especificara la relación dimensional

Los resultados obtenidos de los modelos desarrollados para calcular la CSD a partir de las mediciones FBRM se compararon con las mediciones CSD obtenidas a partir de los análisis de imágenes.

Intentar controlar una mezcla cristalina opaca supone todo un reto, sobre todo cuando las especificaciones de fabricación exigen una distribución del tamaño de las partículas (PSD) limitada. En las formulaciones de cristales de proteínas inyectables, la PSD puede influir considerablemente en la viscosidad y también puede servir como una advertencia anticipada sobre la agregación u otros eventos de degradación que, potencialmente, podrían poner en peligro la formulación. El control in situ fue empleado en un estudio de cristalización escalada por lotes con el objetivo de caracterizar la formación del cristal de la hormona del crecimiento humano (hGH) El análisis en tiempo real pudo detectar una desviación del perfil propio de la PSD causada por diferencias en las mezclas entre recipientes. Esto se confirmó gracia a un análisis de imágenes (IA) posterior y fuera de línea.

• Orehek, J., Teslić, D. y Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review (Procesos de cristalización continua en la fabricación de productos farmacéuticos: un análisis). Organic Process Research & Development, 25(1), 16-42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J. y Hirasawa, I. (2020). Parameter Estimation of the Stochastic Primary Nucleation Kinetics by Stochastic Integrals Using Focused-Beam Reflectance Measurements (Estimación de parámetros de las cinéticas de nucleación primaria estocástica por integrales estocásticas mediante las medidas de reflectancia con haz enfocado). Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V. y Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12 (Control en tiempo real de la cristalización biofarmacéutica: distribución de la longitud de cuerda a la distribución del tamaño de los cristales para la lisozima, la insulina rHu y la vitamina B12). Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C. y Dang, L. (2018). Manipulating crystallization in lysozyme and supramolecular self-arrangement in solution using ionic liquids (Manipulación de la cristalización en lisozima y autogestión supramolecular en solución mediante los líquidos iónicos). CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D. y Orkoulas, G. (2014). Modeling and control of crystal shape in continuous protein crystallization (Modelado y control de las formas de los cristales en la cristalización continua de proteínas). Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G. y Christofides, P. D. (2014). Enhancing the Crystal Production Rate and Reducing Polydispersity in Continuous Protein Crystallization (Aumento de la tasa de producción de cristales y reducción de la polidispersidad en la cristalización continua de proteínas). Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W. y Margolin, A. L. (2004). Protein Crystals for the Delivery of Biopharmaceuticals (Cristales de proteínas para la entrega de biofármacos). Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301