Cristalização de Proteínas

A cristalização de proteínas é o ato e o método de criação de retículos estruturados e organizados para macromoléculas complexas. Proteínas geralmente são amorfas em seu estado sólido e suscetíveis à desnaturação, ao passo que proteínas dispostas em retículos resistem à desnaturação e possuem maior estabilidade. Proteínas podem ser cristalizadas se colocadas em ambientes adequados e favoráveis. A cristalização de proteínas é considerada tanto uma ciência quanto uma arte, devido às interações altamente complexas das variáveis que influenciam o processo de cristalização proteica.

O objetivo mais comum para a criação de cristais proteicos é dar suporte a investigações de biologia estrutural, geralmente por meio da cristalografia por difração de raios X. Entendendo as estruturas tridimensionais das proteínas, os pesquisadores conseguem visualizar áreas na estrutura que permitem a interação com outras moléculas (por exemplo, para entender melhor como as enzimas, substratos e ligantes interagem). Além disso, a cristalização é um meio eficaz para criar proteínas puras livres de contaminantes de outras proteínas ou matéria biológica externa, oferecendo assim um meio alternativo de purificação e separação para a cromatografia preparativa. 

As proteínas têm ganhado cada vez mais importância como medicamentos terapêuticos. Entretanto, produzir proteínas com a estabilidade exigida acarreta desafios importantes, incluindo o da variação de produto, perda da estrutura que reduziria a eficácia e a formação de subprodutos potencialmente perigosos. A cristalização de proteínas é um método para produzir formas de dosagem puras, estáveis e sólidas, e alguns recursos terapêuticos por injeção e infusão estão associados aos cristais proteicos. No passado, a cristalização de proteínas era uma atividade de laboratório para dar suporte à cristalografia por difusão de raios X; atualmente, devido ao crescimento exponencial dos tratamentos à base de proteínas, essa passou a ser uma área de foco intenso e tornou-se muito importante aumentar a escala de cristalizações de proteína para um nível de produção.

Aumentar a escala de cristalizações de proteína é uma atividade essencialmente análoga à de cristalização de pequenas moléculas no que diz respeito aos requisitos para otimizar os Parâmetros Críticos de Processo (CPPs) em escala laboratorial para alcançar os Atributos Críticos de Qualidade (CQAs) de uma substância farmacológica cristalizada em escalas comerciais. Uma plataforma holística para o desenvolvimento e aumento de escala do processo de cristalização de proteínas geralmente engloba:

• Caracterização de Sistema de Partículas in situ
• Monitoramento espectroscópico e caracterização polimórfica
• Otimização do procedimento e estratégias de controle de feedback por meio de módulos e sensores integrados

Há importantes aplicações farmacêuticas associadas à cristalização de proteínas: a química medicinal por meio da biologia estrutural, desenvolvimento de fármacos à base de proteínas, aumento de escala, separação e purificação, formulação e aplicação de medicamentos.

• Química medicinal por meio da biologia estrutural. Avanços nas técnicas de cristalização de proteínas e cristalografia de raios X levaram à dedução de milhares de estruturas tridimensionais de proteínas. Entender detalhadamente as interações fármaco-receptor é possível por meio da determinação da estrutura dessas macromoléculas complexas e visualização dos locais de ligação. Essas informações oferecem um melhor entendimento, em um nível molecular, dos inibidores proteicos, ativadores alostéricos, cofatores e até mesmo dos centros catalíticos de enzimas, ou "centros ativos", – resultando em fármacos mais eficazes. Um exemplo clássico da importância do entendimento da estrutura proteína-inibidor por meio da cristalografia é demostrado pelos grandes avanços no desenvolvimento de proteases do HIV.
• Desenvolvimento, aumento de escala, separação e purificação para tratamentos à base de proteínas. Além de formar cristais proteicos únicos para a cristalografia de raios X, a indústria farmacêutica tem aumentado seus esforços no desenvolvimento de recursos terapêuticos à base de cristais proteicos. O objetivo dessas aplicações é desenvolver e elevar a produção a grandes quantidades de cristais proteicos puros e estáveis que tenham o tamanho correto de partículas, assim como uma distribuição de tamanho de partículas bem controlada. Com relação à cromatografia preparativa, a cristalização de proteínas tem o potencial de ser um meio alternativo econômico de separação e purificação de macromoléculas e de isolamento de moléculas quirais. As ferramentas para aumentar a quantidade de cristalizações de proteínas são análogas àquelas utilizadas para aumentar o número de reações químicas, com a necessidade de entendimento de CPPs e o seu efeito nos CQAs.
• Formulação e aplicação de medicamentos. Tratamentos à base de proteínas são administrados na forma de soluções e podem ser aplicados via injeção ou infusão. Como grandes quantidades de proteínas precisam ser administradas, as soluções proteicas infundidas são diluídas para evitar viscosidade e problemas de aglutinação. Isso é menos conveniente para o paciente e para o hospital, devido ao tempo necessário para infundir todo o tratamento, e, além disso, uma menor conformidade do paciente com qualquer forma de administração parenteral pode contribuir com esses fenômenos. Utilizar a forma cristalina das proteínas em suspensão é de maior interesse, já que essas formulações apresentam menos problemas de viscosidade e podem ser aplicadas em maior concentração. Outro fator chave é o tamanho dos cristais proteicos, que deve ser cuidadosamente controlado para garantir que a suspensão consiga atravessar facilmente a agulha da injeção ou infusão. Além disso, o tamanho de qualquer cristal residual que não tenha dissolvido durante a reconstituição não deve ultrapassar o parâmetro crítico de partículas, que, se excedido, pode provocar efeitos colaterais devidos à acumulação capilar no sistema vascular, frequentemente minimizando quantidades significativas de partículas >15 µm. 

1. Escolha um solvente apropriado. Considerações frequentes incluem quanto soluto pode ser dissolvido (solubilidade), qual a praticidade de manuseio do solvente (segurança) e como o solvente afetará a estabilidade e os estados de energia livre dos peptídeos ou proteínas.
2. Alcançar a supersaturação. Aqueça a substância solúvel do medicamento à base de peptídeos/proteínas em um solvente ou faça o tamponamento até a tolerância máxima permitida (geralmente limitada pela desnaturação). A solução se tornará supersaturada.
3. Cristalizar o produto por meio do controle de CPPs. Reduza a solubilidade por meio do resfriamento, adição de um antissolvente, evaporação ou reação. Com a solubilidade reduzida, um ponto é atingido onde os cristais sofrerão nucleação e crescerão. Com isso, deve haver o crescimento de cristais de elevada pureza, embora padrões com alto índice de energia livre possam formar estruturas alternativas ou não cristalinas, o que deve ser evitado por meio de um controle cuidadoso de CPP, sempre que praticável.
4. Permita que o sistema alcance o equilíbrio. Isso é feito para maximizar o rendimento do produto farmacológico sólido.
5. Filtre e seque o produto purificado.

Há vários métodos empregados para aumentar o crescimento de cristais proteicos, entres eles, os mais comuns são a difusão de vapor e microbateladas. Este último apresenta duas variações, descritas como gota suspensa e pendurada, ambas essencialmente funcionando da mesma maneira. Em um sistema vedado, uma gota da solução contendo a proteína, tampão e precipitante equilibra-se com um reservatório em cujo conteúdo há concentrações mais elevadas de soluto da mesma solução, mas sem a proteína. A água da gota contendo a proteína vaporiza e é atraída para a solução de maior concentração no reservatório. À medida que a concentração de soluto na gota aumenta, a proteína começa a cristalizar. No método de microbatelada, as proteínas e outros reagentes são introduzidos e contidos sob uma fina camada de óleo mineral, que elimina a difusão da água. A microbatelada é essencialmente um pequeno reator contendo todos os ingredientes necessários nas concentrações corretas e estáveis para permitir que a cristalização ocorra.

Descobrir o conjunto correto de reagentes, parâmetros e condições necessárias para cristalizar uma proteína geralmente envolve empirismo e, portanto, a maneira mais prática de obter êxito na cristalização de proteínas é utilizar variadas condições experimentais que se baseiem na experiência prévia. A maneira mais simples de fazer isso é usar os kits de triagem de cristais proteicos comercialmente disponíveis, que contêm soluções já preparadas com tampões, precipitantes etc., contidas em placas de poços múltiplos. O método de difusão de vapor por gota suspensa é aplicado para o crescimento de cristais com esses kits. Quando uma triagem de larga escala é necessária, há sistemas de alto rendimento disponíveis que automatizam o método de microbatelada, poupando tempo e evitando a fadiga enquanto minimizam a quantidade de proteína purificada exigida. Para as cristalizações de proteína de grande escala exigidas pelas aplicações farmacêuticas ou industriais, as informações obtidas nos experimentos de triagem formam a base para a aplicação em sistemas de reator automatizado de grande escala, caracterizados por PAT in situ e em tempo real. 

Para auxiliar no processo de desenvolvimento e fabricação, uma das etapas iniciais mais importantes na cristalização bem-sucedida de proteínas é garantir a disponibilidade de um suprimento adequado de proteína com alto grau de pureza e boa caracterização. Além de ser pura (isto é, livre de contaminantes como impurezas de matrizes de fermentação), a proteína deve ser homogênea e estável (ou estabilizada) em uma solução com:

• Agregação mínima (Imagem A)
• Estrutura secundária, terciária e quaternária correta (Imagem B)
• Quaisquer modificações conjugadas ou recombinantes (Imagem C)

Além disso, todos os reagentes e solventes utilizados no processo de cristalização de proteínas precisam estar livres de contaminantes, já que estes podem impactar significativamente a nucleação.

Semelhante à cristalização de pequenas moléculas, as proteínas se cristalizam a partir de soluções supersaturadas. No caso de moléculas pequenas que formam retículos cristalinos robustos, a temperatura de manipulação é a principal forma de alcançar a supersaturação, e isso também interessante para as proteínas. No entanto, uma faixa reduzida de temperatura é aceitável, já que os cristais de proteínas geralmente têm o solvente como parte da estrutura cristalina e, assim, costumam ser sensíveis à temperatura e suscetíveis à desnaturação e agregação.

Moléculas pequenas têm graus de liberdade estereoscópica substancialmente inferiores e, como resultado, cristalizam-se com muito mais facilidade. Peptídeos de moléculas grandes têm um índice muito mais elevado de interações ácidas, básicas, polares e não polares e forças repulsivas que resistem à cristalização ordenada, um fenômeno que é exacerbado no caso de proteínas ainda maiores. A maioria dos peptídeos compatíveis com a cristalização também contém um número expressivo de ligações dissulfeto, que são cruciais na imobilização de padrões estruturais. A extensão da desorganização intramolecular ou possível variação na estrutura são atributos importantes na determinação de se o peptídeo ou proteína podem mesmo se cristalizar em vez de precipitar. Mesmo que a molécula apresente atributos com predisposição favorável à cristalização, há um número de parâmetros de processo que influenciam a viabilidade comercial do processo e precisam ser caracterizados.

Além da temperatura, há vários outros fatores que afetam/auxiliam a cristalização de proteínas por meio da supersaturação, incluindo o ajuste de pH e a força iônica de uma solução, a adição de sais e precipitantes como PEG para ajudar a reduzir a solubilidade, o tipo de ligante presente etc. O ponto chave é supersaturar a solução dentro de um ambiente que não interfira nas características normais da proteína. Isso implica a importância de identificar um conjunto de variáveis e condições que resultem em cristais de pureza e morfologia corretas e taxas de crescimento aceitáveis.

A cristalização de proteínas é realizada por meio de uma série de mecanismos interdependentes:

1. Nucleação
2. Crescimento
3. Separação do Óleo na Cristalização
4. Aglomeração
5. Ruptura
6. Semeadura
7. Química de Polimorfismo

Esses mecanismos, que geralmente são invisíveis para os cientistas, cumprem uma função dominante na definição do produto de um processo de cristalização.

O desenvolvimento e aumento de escala de cristalizações destinadas ao tratamento terapêutico à base de proteínas exigem um entendimento profundo das variáveis e condições que afetam o processo de cristalização. Assim como em outras cristalizações, obter a forma, o tamanho de partícula e distribuição de tamanho desejados para os cristais exige um controle cuidadoso que vise à qualidade consistente do produto. Quaisquer variações nos CQAs das suspensões de cristais proteicos afetarão diretamente a eficácia terapêutica. Como os cristais de proteínas são extremamente sensíveis ao ambiente onde crescem e podem ser facilmente danificados por um excesso de temperatura, perda de solvente e outros fatores externos de estresse, até mesmo o processo de amostragem, é desejável medir os CPPs e a qualidade do produto in situ, isto é, sem a remoção dos cristais de seu ambiente de solução.

• Os reatores químicos automatizados EasyMax e Optimax permitem o controle preciso, ajuste e registros de parâmetros, incluindo a temperatura, pH, condutividade, taxa de agitação e dosagem de tampões e excipientes, que são crucialmente importantes para o sucesso do desenvolvimento e aumento de escala de cristalizações de proteínas
• Ferramentas de tecnologia analítica in situ que auxiliem no monitoramento, solução de problemas e correção de desvio de processo também são úteis
  • A espectroscopia Raman in situ e a espectroscopia FTIR monitoram as concentrações de reagentes, o crescimento da estrutura cristalina e também medem a concentração de soluções supersaturadas
  • A tecnologia ParticleTrack (com FBRM) monitora o tamanho e a distribuição de tamanho variáveis dos cristais em tempo real, enquanto outras etapas essenciais do processo de cristalização são realizadas
  • O EasyViewer permite a visualização e análise da imagem do processo de cristalização à medida que ele avança

Quando reatores automatizados de laboratório são utilizados em conjunto com analisadores in situ de tempo real, é possível identificar o impacto dos parâmetros do processo nos mecanismos de cristalização, como a agregação, crescimento, aglomeração, ruptura e alteração de forma. O controle preciso do processo de cristalização em conjunto com o monitoramento contínuo e in situ do andamento da formação cristalina permite que a otimização e o aumento de escala sejam baseados em fatos e direcionados por dados.

O reator de laboratório automatizado EasyMax é uma estação de trabalho completa para a otimização de parâmetros da cristalização de proteínas, cujo objetivo é dar suporte ao desenvolvimento, projeto e execução do aumento de escala. Esse sistema totalmente automatizado permite o controle preciso sobre parâmetros de processo.

• Gerencie CPPs, incluindo as taxas de dosagem, temperatura, agitação, pH e condutividade
• Prontamente integrado com a análise de cristalização in situ, incluindo ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) e EasyViewer (análise de imagens in situ)
• O software iC permite a execução e o controle automatizados de todos os experimentos e equipamentos periféricos, bem como a coleta completa de dados e manutenção de registros

O ReactIR usa a espectroscopia de infravermelho médio para medir a fase da solução nos estudos de cristalização. As medições do ReactIR não são afetadas por sólidos em suspensão, bolhas ou massa de partículas.

• Monitore individualmente solutos de cristalização in situ e em tempo real.
• Meça as concentrações da solução para dar suporte aos estudos de supersaturação
• Forneça análises de dados acionáveis para tomadas de decisão e controle em tempo real

O ReactRaman usa a espectroscopia Raman para fornecer uma análise molecular das partículas em solução

• Monitore o crescimento, a estrutura e a morfologia de maneira não destrutiva, em situ e em tempo real
• Determine os efeitos dos parâmetros e otimize as condições de cristalização e variáveis para alcançar as metas de qualidade

O ParticleTrack usa a tecnologia de Medida de Reflectância por um Feixe de Luz Focalizado (FBRM) e é um instrumento óptico cujo funcionamento se baseia em um sensor que é inserido diretamente em um recipiente, para acompanhar a alteração do tamanho e contagem das partículas em tempo real. O ParticleTrack utiliza medições de Distribuição de Comprimento de Corda para obter a Distribuição de Tamanho do Cristal (CSD).

• Os cristais proteicos são monitorados continuamente à medida que as condições experimentais variam
• Monitore a batelada ou o crescimento contínuo durante a cristalização em tempo real, sem necessidade de remover a amostra
• Caracterize condições que afetam a nucleação, agregação, polimorfismo e outros atributos do sistema

O EasyViewer é um instrumento baseado em sensor que é inserido diretamente em um recipiente para captar imagens dos sistemas de partículas. O EasyViewer realiza a análise de imagem, mede a contagem de partículas, distribuição de tamanho e morfologia de imagens em linha resolvidas no tempo do processo, permitindo analisar as tendências de populações ao longo do tempo.

• Os cristais proteicos são monitorados continuamente à medida que as condições experimentais variam
• Monitore a batelada ou o crescimento contínuo durante a cristalização em tempo real, sem necessidade de remover a amostra
• Visualize os parâmetros de cristalização que afetam a nucleação, agregação, polimorfismo e outros atributos do sistema, em tempo real

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., e Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Os autores relatam o sucesso no desenvolvimento de uma abordagem eficiente para o monitoramento em tempo real de cristalizações biofarmacêuticas. Esse procedimento utiliza o ParticleTrack para medir o CLD em uma série de moléculas de interesse biofarmacêutico tanto sob condições estáticas quanto dinâmicas, e então aplicar um modelo matemático para converter o CLD em CSD. As biomoléculas investigadas têm formas cristalinas diferentes, que são dependentes das condições experimentais da cristalização. A lisozima pode produzir cristais tetragonais com formato de agulha; a insulina rHu, cristais na forma de romboedro e B12, cristais poliédricos.

Os autores desenvolveram modelos para determinar o CSD para os cristais tetragonais, romboédricos e poliédricos de baixa razão de aspecto e os cristais em forma de agulha de alta razão de aspecto. Os autores utilizaram três modelos distintos para determinar a distribuição de tamanho dos cristais:

• Um modelo desenvolvido por outro grupo de pesquisa que levantou a hipótese de que os cristais poderiam ser representados como esferas (diâmetro esférico equivalente, SED) foi eficaz para os cristais de baixa razão de aspecto
• No caso dos cristais de alta razão de aspecto, os autores desse estudo desenvolveram um modelo baseado na largura
• Por fim, eles desenvolveram um modelo cuja base era a largura e exigia que a razão de aspecto fosse especificada

Os resultados dos modelos desenvolvidos para calcular CSD a partir das medições de FBRM foram então comparados às medições de CSD obtidas pela análise de imagem.

Tentar monitorar uma pasta cristalina opaca é desafiador, especialmente quando as demandas de fabricação exigem uma distribuição de tamanho de partículas (PSD) rigorosa. No caso de formulações à base de cristais proteicos, PSD pode influenciar fortemente não só a viscosidade como também servir como um alerta antecipado da agregação ou outros eventos de degradação que possam comprometer a formulação.O monitoramento in situ foi utilizado em um estudo de aumento de cristalização em batelada para caracterizar a formação e o crescimento do cristal do hormônio humano do crescimento (hGH). A análise em tempo real detectou um desvio do perfil usual de PSD causado por diferenças na mistura entre os recipientes. Isso foi confirmado pela Análise de Imagem (IA) off-line subsequente.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameter Estimation of the Stochastic Primary Nucleation Kinetics by Stochastic Integrals Using Focused-Beam Reflectance Measurements. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., e Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulating crystallization in lysozyme and supramolecular self-arrangement in solution using ionic liquids. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modeling and control of crystal shape in continuous protein crystallization. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Enhancing the Crystal Production Rate and Reducing Polydispersity in Continuous Protein Crystallization. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Cristais de Proteínas para a Produção de Produtos Biofarmacêuticos. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301