生物催化 | 酶催化

生物催化亦称为酶催化，使用生物活性成分来催化化学转化。生物催化促进了一系列主要以碳为中心的反应，此类反应可发生在完全体外的无细胞环境、以及基于活细胞培养的发酵工艺等各种环境中。

基于许多原因，生物催化成为了传统化学催化的一种有用的替代方法。酶促生物催化剂反应：

• 具有高度的化学、区域和对映选择性
• 通常具有快速动力学
• 比化学催化剂的反应条件更加温和
• 消除了金属催化剂的废料、毒性和成本问题
• 降低了与化学反应相关的能量需求

生物催化剂的定向工程提高了高温下催化剂的稳定性，使生物催化在制药、化学、生物燃料和食品行业中得到广泛应用。

生物催化与“绿色”、可持续和经济有效的化学产品制造有关。相对于化学催化，生物催化剂针对合成具有固有的优势，其中包括：

• 显著的化合物多样性，可以来自天然也可以来自基因工程，可应对广泛的化学转化
• 生物催化反应的特异性，减轻了对某些传统化学合成/加工策略的需求，如使用阻断/去阻断基团，对映异构体混合物分离，以及去除不需要的副产物的工作
• 基础设施和原料要求的简化，因为许多生物催化过程可在单锅反应中执行，消除了传统化学催化所需的分步骤反应  

生物催化中使用的酶具有非常重要且常用的能力，其中包括：

A) 其他生物制剂或小分子的官能团或位点特异性键合以及靶点识别

B) 促进了其他生物制剂或小分子的结合或置换

C) 促进离子传输的结构或静电特性

D) 从有序到无序的结构转化，因此，具有不同的催化活性

E) 诱导或抑制酶活性的变构或间接修饰

对改进或修饰的重组生物催化剂的研究一直在扩大其在严苛化学领域的实用性，以提高反应范围、酶的稳定性和可重用性。天然和工程生物催化剂现在可以用于执行关键的化学转化，如形成C-C键、酰胺键，从而形成手性胺和C-H功能化。

用于生物转化的酶范围异常广泛，几乎跨越了所有的工业行业，包括食品、制药、纺织品、生物燃料、造纸、化学品和家居产品。在精细化学物质、药物和相关中间体的合成中，生物催化（即酶催化或酶介导催化）已迅速发展成为一种实用性技术。酶可用于各种生物转化，如氧化、还原、加成和消去。 

六种主要种类的酶和应用示例： 

1. 氧化还原酶催化分子的氧化和还原。 具有分子氧的单加氧酶可以实现C-O键的形成，而特定的酶则用于实现醇、酮、醛和胺的氧化。在还原方面，酮还原酶(KREDS)和脱氢酶能够实现对映异构醇的合成。其他酶可以还原键，如C=N，从而将腈转化为胺。 

2. 转移酶用于将官能团从一个分子转移到另一个分子。激酶和磷酸酶（磷酸盐的加成和消去）对于分子信号级联、DNA复制、RNA转录和其他功能尤为重要。还有许多具有生物学意义的转移酶可以服务于多种功能，如酮或醛转化为胺，并且可以立体选择性方式执行这些过程。

3. 水解酶催化各种基质的水解。核酸酶或蛋白酶在核酸和肽循环中种类丰富且必要。脂肪酶、蛋白酶和酰化酶等水解酶充当Michael 1,4-加成的催化剂，此反应被广泛用于形成C-C和碳-杂原子键。

4. 裂解酶通常通过形成或消去双键来催化反应。与水解酶的取代反应不同，羧化酶或脱羧酶反应在药物生物催化的CO₂添加或去除中很常见，C-N裂解酶同样如此，它可以用于生成取代天冬氨酸和丙氨酸等氨基酸。

5. 异构酶可以实现分子中原子的重排。外消旋酶等异构酶会在目标手性碳处反转立体化学结构，顺反异构酶则会催化烯烃或环烷烃中顺反异构体的异构化。通过葡萄糖异构酶实现的葡萄糖到果糖的转化是一种重要的工业酶生物转化。

6. 连接酶通过连接两个分子形成一个更大的分子来形成新的化学键。其中最重要的应用之一是使用DNA连接酶形成重组DNA分子，与内切酶或外切酶互补。

生产酶催化剂。 一般来说，用于生物催化的天然或重组酶首先是通过常用的细菌的发酵合成的，但偶尔也衍生自酵母培养物。虽然酶可能在更复杂的哺乳动物细胞培养中产生，但细菌和酵母通常包含足够的和自然发生的分子通路，以实现重组生物催化酶所需的折叠和恰当的翻译后修饰。通过这种发酵产生的酶通常通过裂解或其他破坏细胞结构的方式来释放重组酶，并在类似于其他生物制药的工艺中进一步纯化。发酵、收获和下游工艺也具有自己的挑战，这可以通过利用过程分析技术(PAT)来解决。

稳定化和固定化。 酶固定化可实现更稳定、更具活性和可重复使用的酶。一般来说，交联酶聚合物(CLEA)可以通过许多不同的固体基质如二氧化硅、树脂或PEG等聚合物，甚至脂质纳米粒子(LNP)等其他复合物一起形成。对于某些流动化学应用，CLEA也可以在表面和传感器上形成，例如用于分析和催化用途的表面增强测量的传感器。相关组分合成、吸附、偶联或其他关联以及产品稳定性和制剂的挑战可以通过参考疫苗制剂和佐剂工艺的类似解决方案来解决。

产物捕获和隔离。生物催化后，CLEA从产物和残留反应物中分离出来，然后可以回收或以其他方式保留。小分子产物可以通过过滤或层析工艺分离，但许多工艺仍然倾向于结晶方法。大分子生物催化产物通常会继续使用传统的下游工艺工作流程。

了解任何自由键合、基质键合或表面固定化酶的实际半衰期和稳定性对于设计适当的生物催化方案都至关重要。考虑事项包括：

• 溶剂——许多天然酶难以应对有机溶剂反应。不断进化的工程或重组酶正在提高与有机溶剂条件的相容性。重组酶现在能够在有机溶剂环境中催化反应，例如，能够使用修饰磷酰胺进行寡核苷酸合成。
• pH——酶的最佳运行pH值范围非常窄，并且只能耐受<0.5的pH单位变化。因此，pH值控制通常是许多生物催化反应所考虑的一个关键参数，而且手动控制可能很困难或繁琐。 
• 温度——天然酶及其重组酶对应物能够有效发挥作用的特定温度范围也非常窄。温度波动可能会导致反应动力学、产物产量或其他关键工艺结果的变化。
• 溶解氧——这个关键的工艺参数，对氧化和还原反应尤其重要，通常通过氧气或惰性气体的喷射或顶空加样进行控制。为了确保氧化还原酶能够在峰值效率下工作，优化溶解氧（包括气泡特性）的含量和传质非常关键。
• 混匀、流体动力学和气体——合适的搅拌装置可能会对生物催化酶的生命周期产生很大的影响，特别是在长时间、流动化学或灌流方式运行时尤其如此。如果混匀不够充分，生物催化反应的规模放大可能达不到最优。混匀对于合适的气体分布和传质也至关重要。
• 反应化学计量学——正确的试剂-酶比例非常重要，可以通过实验设计(DoE)研究来确定，而该实验通过化学反应器自动实现，并通过工艺开发中集成的PAT提供辅助。

生物催化反应的开发和规模扩大取决于所使用的特定生物催化剂的性质、基质、辅助因子和所应用的反应条件。与化学催化反应相同，这种复杂的、相互依赖的变量矩阵可以通过对反应变量的仔细控制，结合实时分析测量的信息来得以最好地理解。然而，许多现代工艺的工艺开发、规模放大和数据密度限制都与生物催化反应的持续手动控制有关，这需要大量的时间和资源成本。人工操作意味着人员要出现在生物反应器旁边进行几乎恒定的照料、调整和取样，以满足对工艺表征和技术转移日益增加的监管和学术需求。

生物催化的无人值守运行可以通过实验室自动化平台来实现，这种平台将针对通过集成传感器和过程分析技术(PAT)连续测量的动态反应条件做出响应。自动化合成反应器平台有助于加快实验进度，并且减少人为误差或干预。结合用于离线色谱分析的模块化、自动化的反应器取样，所有关键工艺参数(CPP)均可进行叠加和趋势分析。参数控制和过程分析数据自动实时记录，并结构化以便进行数据管理和归档。不同反应器规模间的实验波动性降低，可重复性提高，进一步简化了循证的规模扩大。

• EasyMax和OptiMax自动化反应器对于确保温度、pH值、混合速率和加样等生物转化关键变量影响的精确控制、有效建模和记录具有重要的作用。
• ReactIR和ReactRaman原位光谱技术对于实时跟踪和测量关键反应物种类非常有用。ReactIR会跟踪溶液中的关键分析物，而不受全细胞等悬浮颗粒的干扰。
• 带有FBRM技术的ParticleTrack用于测量非均匀悬浮液中的颗粒大小和分布。EasyViewer用于捕获系统中颗粒的原位图像、浊度、形状、大小、形态、计数和分布进行实时图像分析。
• EasySampler则可以实现全自动和无人值守的化学反应取样，包括为离线分析做准备时的淬灭和样品稀释。

EasyMax自动化反应器作为完整的工作站，可用于生物催化中的参数优化，从而支持开发、规模扩大和实现。这种全自动系统可精确控制工艺参数。

• 管理CPP，包括来料鉴定、加样速率、温度、搅拌、顶空、喷射，pH值测量和滴定
• 可随时与生物催化原位分析方法进行整合，包括ReactIR (FTIR)、ReactRaman（拉曼）、ParticleTrack (FBRM)、EasyViewer（原位图像分析）与EasySampler（自动化原位反应器取样）。
• 无需看管即可进行实验；可在需要离线分析时进行智能自动化取样。
• iC Software可自动执行和控制所有实验与外围设备以及全部数据采集与记录保管工作

ReactIR使用FTIR光谱法同时测量生物催化研究中的水溶和有机溶解组分。ReactIR测量不受悬浮固体、气泡或者其他粒子质量的影响。

ReactRaman使用拉曼光谱法支持颗粒和反应分析的分子分析。

• 在容器或流动工艺流中原位且实时地监控多种产品质量属性
• 消除取样延迟
• 对加工步骤对于产品产量和工艺效率的影响进行定量
• 为实时决策与控制提供可行的数据分析
• 通过数据丰富的实验与数字化帮助符合ICH监管准则
• 从研发到生产全面帮助规模放大
• 可在几毫升到数千升的液体体积中测量低至500 ppm的分析物浓度

ParticleTrack采用聚焦光束反射测量 (FBRM)技术，是一种基于探头的光学颗粒分析仪，可直接插入容器内，从而实时跟踪粒度与粒数的变化情况。ParticleTrack利用弦长分布(CLD)测量获得粒度分布(PSD)。

• 随着实验条件或参数的变化，会对颗粒和颗粒结构进行持续监测
• 表征固相颗粒的合成，酶的固定化，裂解和相关的过程形态
• 实时跟踪生物催化过程中生物催化产物的分批或连续增长，而不需要去除样品
• 影响成核、沉淀、多态性和其他系统属性的颗粒系统条件的表征

EasyViewer是一种基于探头的粒径分析仪，可直接插入容器内捕捉粒子系统的图像。EasyViewer可提供图像分析，并基于随时间变化的过程在线图像测量粒数、粒度分布和形态，从而确定颗粒群随时间产生的变化趋势。

• 随着实验条件或参数的变化，会对颗粒和颗粒结构进行持续监测
• 表征固相颗粒的合成，酶的固定化，裂解和相关的过程形态
• 通过气泡表征测量传质(K_La)
• 实时跟踪结晶过程中生物催化产物的分批或连续增长，而不需要去除样品
• 影响成核、沉淀、多态性和其他系统属性的颗粒系统条件的表征

ReactIR提供了优化酯合成的深入洞察

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). R-巴氯芬前体的工艺开发 有机工艺研发, 25(1), 136–147

在复杂分子的开发过程中，化学家们正在寻找简化多步骤合成的方法。使用酶作为催化剂以及在外消旋化合物的分解中使用酶已经非常成熟。原位分析技术则具有补充作用，可对各个合成步骤中化学和生化转化的优化提供巨大帮助。

在这项研究中，研究人员参与了一种用于酒精滥用疾病的药物——阿巴氯芬的多公斤合成的开发。其中一步要合成一个关键的琥珀酸酯中间化合物，并随后将酯分解为单一(S)-对映体。为了获得足够数量的这种单一对映体，他们探索了两种不同的方法，制备手性色谱法和酶解法。后一种方法被认为更加优秀，他们发现固定在聚甲基丙烯酸酯上的C. antartica A脂肪酶（IMMCALA-T2-150脂肪酶）为分解的琥珀酸酯中间体提供了可行的途径。

为了最初合成琥珀酸酯，他们发现类似的硫代碳糖酸化合物与硫酰氯反应，可产生所需的酯。为了优化酯的产量，并最大限度减少副产品，他们采用了ReactIR。原位FTIR表明，当硫代碳糖酸盐化合物和硫酰氯发生反应时，形成的中间氯甲酸盐化合物具有有限的热稳定性。该中间体形成后并在分解前，加入正-羟基琥珀酰亚胺，然后加入三乙胺。三乙胺的加入具有高度放热性，从而导致氯甲酸盐中间体转化为所需的琥珀酸酯。

ReactIR示踪关键的生物碳酸盐浓度

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). 以CO₂为底物，胺街道酚类化合无的酶羧化反应提高了平衡转化率和反应速率生物技术杂志, 12(12), 1700332

作者发现，二羟基苯甲酸（去）羧化酶会催化可逆的区域选择性正（去）羧化，并产生了极大的兴趣，因为他们要在比各自化学催化剂低得多的温度和压力下进行羧化。在目前的工作中，他们报道了来自稻曲霉的2,3-二羟基苯甲酸（去）羧化酶作为催化剂，可实现酚类分子的正羧化，这与共基质CO₂的同时胺调节原位转化为碳酸氢盐有关。

作者指出，共基质CO₂，即水合形式碳酸氢盐的性质在酶的羧化中非常重要，因为基质键合和激活机制决定了实际的羧化剂。在他们的研究中，一个配备了金刚石ATR插入探针的ReactIR被用来跟踪碳酸氢盐的形成。作为这项研究的成果，他们报告了显著提高生物催化羧化的转化和反应速率的反应条件的形成。

ReactIR研究与各种基质的氧化偶联，帮助优化反应条件

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). 漆酶介导的C-C耦合：各种反应监测技术。 过程生化, 50(10), 1591–1599.

作者报告研究了真菌漆酶(Novozym 51003)在酚类化合物中氧化C-C偶联的应用。漆酶已知可适用于将氧化苯、苯胺等氧化成醌，并通过O₂还原为水。漆酶偶联通常被认为不具有选择性，因此作者发起了一项关于各种酚类基质中漆酶氧化的研究，以确定C-C偶联的有效性/选择性。他们确定，2,6二取代酚的氧化二聚体不仅具有高度的选择性，而且能够显著放大。他们证明，合成的2,6二异丙基苯酚氧化产物很容易还原为类似的双酚化合物。

在本研究中，研究人员最初在漆酶启动氧化过程中通过氧测量来选择了目标基质。然后，他们使用ReactIR（原位FTIR光谱法）研究了漆酶与特定酚类基质引发的偶联反应的有效性和选择性，并确定最大限度地提高产物的最佳条件。原位FTIR研究表明，区域选择性、对称二醌合成发生速度相当快。此外，原位FTIR可用于监测通过漆酶氧化发生的聚合，并且由于FTIR-ATR方法只跟踪溶质分析物，聚合物沉淀不会干扰测量。  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen.Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., “Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19”, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
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• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., … Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir.Science, 366(6470), 1255–1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
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