生物制药下游加工

生物制药下游加工（亦称作DSP）是指从自然资源（例如：动物或细菌细胞）中回收和纯化原料药（DS）。 生物制药下游加工可用于mAb或蛋白加工，以及寡核苷酸、多糖和各种疫苗的生产。

下游加工通常定义为细胞生长和扩增以及药物合成或其他产物形成完成后的单元操作。 下游加工的目的是从复杂的本体基质中分离、纯化和浓缩先前合成过的原料药或其他产物。

下游加工可能还包括配方操作，这代表着从原料药向药品（DP）的过渡。 此外，下游加工还需要考虑到资源管理以及多种废物流和生物危害管理等因素。 下游加工操作以实验室、中试和制造规模进行，需要专注于过程优化、放大生产与故障排除的过程分析技术（PAT）和制造科学与技术（MSAT）团队的参与。 

根据产品以及合成方法的性质，下游加工（DSP）通常包括下列步骤：

• 收获和过滤
  收获是将产品与大块碎屑分离的第一步，同时可最大限度保持产品产量与质量
  
  
• 初级富集
  富集指保留所需的产品，同时最大程度地减少残留的杂质和副产物。 它与“收获”的不同之处在于基本上所有大块碎屑都将被清除。
  
  
• 缓冲液交换和上浓缩
  超滤（UF）浓缩稀释的产品流，并根据膜孔径或截留分子量对溶液中的分子进行分离。 渗滤（DF）将产品从现有缓冲液交换为用于后续工艺的新缓冲液，或者最终配方缓冲液。 超滤（UF）与渗滤（DF）共同构成了缓冲液交换的步骤。
  
  
• 纯化（以及清除污染物或杂质）
  纯化通过采用的每一种连续方法去除残留杂质，同时保留尽可能多的产物。 目标是实现产品纯度，同时最大程度降低减产的可能性。
  
  
• 生物共轭（取决于分子）
  生物共轭分子是新一类或新一代生物分子，通过两种或多种治疗类型分子的组合功能达到更高功效。 抗体——药物偶联物（ADC）是较常见的生物偶联物之一，通过对抗体进行生化改性，以及将其与另外一种活性药物成分（API）共价结合进行合成.
  
  
• 配方
  配方是将原料药（DS）转变成药物（DP）的过程。 配方将环境、溶剂中或其他物理状态的产品分子转变为适合临床用药的形态。

• 深度过滤，中空纤维根据产品与过程的性质，收获方法通常包括深度过滤（图1）或中空纤维过滤器（图2）。 深度过滤是将混合物泵送通过一个薄膜或另一个界面，从而将碎屑与悬浮液中的产品分离。 中空纤维过滤器在连续生物加工操作中使用，以去除通过上清液表达的原料药（DS），同时将一部分生物质暂时存留在中空纤维过滤器中。 声场流分离是目前开发环境中使用最多的另一种新兴技术。 由于操作与配置模式的不同，因此结果可以：
  • 不对细胞或粒子分离进行调节（图3a）
  • 通过对第二个粒子群分流或分离，选择从进料流进入新富集流的细胞或分离（图3b）
  • 将整个粒子系统重新放入新流中以及/或者重新分配流体（可能在再循环中）（图3c）
  • 以水动力方式相互作用，有可能形成粒子选择和流体交换的调制混合物（图3d）

• 离心法：然而，随着高到极高总生物量以及中等最终活细胞密度趋势的日益普遍，作为生物加工中另外一种被广泛采用的分离方法，离心法更多地被视作瓶颈，并且不被广泛认作连续生物加工的实用方法。
  
  
• 酸/表面活性剂裂解，有机相吸收：通过裂解实现的产物分离通常追求一个基本目标：有效破坏包含原料药或产物的螯合结构，并且实现任何碎屑或其他杂质与原料药之间的物理分离。 酸或表面活性剂裂解几乎完全与细菌表达（偶尔与酵母表达）一同使用。 同样，产物的有机相吸收与富集在细菌表达和生产系统中最常见，偶尔用于酵母系统。
  
  
• 絮凝和沉淀：这些是通过操纵活性粒子系统，以实现分离目标的方法。 絮凝通常用作过滤或离心之前的制备方法。 采用絮凝可以确保过滤装置保持高通量，以及高效经济地分离浮层中的细胞物质。 可能需要使用其他的絮凝剂去除方法和验证方案。 沉淀是通过更改参数（例如溶剂、离子强度），从而降低溶解度而进行的活性粒子操纵。
  

已知粒度分布（PSD）是涉及过滤器容量的一种关键工艺参数（CPP），比单独的浊度和压力更具影响力。 可不断整合粒度分布（PSD），从而将粒子积聚映射到过滤器（位于过滤器上方的探头）上，以及预测故障。 还可在过滤器下方测量粒度分布，以观察微量粒子穿透以及识别类似情况。

富集方法和策略因靶分子的性质而略有变化。 原则上，抗体通过亲和树脂（例如蛋白A和蛋白G）以及其他一些选择性工程方法富集。 非抗体蛋白和寡核苷酸更多的是通过离子交换色谱法（IEX）富集。 诸如多糖和复杂的聚糖结构之类的产品通常通过疏水作用色谱法（HIC）或反相色谱法（RPC）富集。

• 亲和色谱法（蛋白A / G）是一次色谱法（通常称为蛋白A或ProA），当其他组分通过亲和柱洗脱（图b）时，通过异性结合作用（图a）将靶蛋白反向粘合或保留在亲和柱上，从而将目标产物（通常为mAb）与其他可溶性物质分离和浓缩。 一系列洗涤步骤加上之后的选择性洗脱将靶分子释放（图c）。 使用亲和色谱法时会产生一些问题，例如：将靶蛋白最大限度粘合至亲和柱（柱载量）。 许多这些问题目前由内置紫外系统进行解决，该系统尽管符合目前的要求，但是缺少原位FTIR等方法具备的功能。
  
  
• 离子交换色谱法（IEX）是在当其他组分通过交换柱洗脱时，根据与固相物质静电作用的强度（图d），将靶分子反向粘合或保留在柱上，从而将目标产物（蛋白、寡核苷酸等）与其他可溶性物质分离和浓缩。 离子交换色谱法（IEX）通常用作纯化的附加或替代方法，因此不仅限于富集应用。

超滤（UF）常在下游生物加工中用于浓缩稀释产物流。 超滤（UF）根据膜的孔径或截留分子量分离溶液中的分子。 渗滤（DF）最常用于将产物交换至目标缓冲液中（例如从洗脱缓冲液交换至最终配方缓冲液中）。

• 超滤和渗滤（统称为缓冲液交换）通常使用切向流过滤（TFF），其中进料平行于膜表面而不是垂直于膜表面流动。 缓冲液交换依然是明显的手动操作，很少能够得到优化。 产物浓度通常通过紫外光谱的形式进行分析，既可以独立使用，也可以用作HPLC检测器，或者用作可变光程法。

缓冲液交换过程中存在着许多的难题：

• 准确跟踪交换量
• 通过非代表性的取样可靠预测过程
• 离线测量响应时间延迟缓慢
• 萃取性取样造成产品不断损失
• 为离线UV和HPLC测量进行样品制备过程中错误层出不穷
• 原位IR与拉曼光谱法可同时分析多种组分，精确度更高、范围更广并且可避免离线分析过程中出现的延迟。 

有多种依次采用的用于提高原料药（DS）纯度的方法，首先是早期澄清和萃取步骤，然后是一种适合的富集方法与首次批量分离，再然后是中间物以及纯化的最终阶段，后者包括精制色谱、纳米/无菌过滤、结晶和病毒清除。

通过消除离线分析过程中出现的延迟，原位FTIR测量通过在中间物纯化步骤中提供即时反馈来定量和形成馏分组分（包括缓冲液，原料药和杂质），改进精制色谱步骤。 这样可以实时改进馏分、聚合物或碎片的识别度以及总浓度。 为了清除病毒，通常通过改变病毒周围的环境，将存在于混合与半纯化治疗性悬浮液中的任何病毒故意损坏，或者突然畸变为非致病性形式。 通过配备内置生物物理传感器的自动化反应器平台可对这些关键工艺参数（CPP）进行控制和改进。 在线过程分析技术（PAT）对于在纯化后期表征杂质非常有用，因为浓度通常较高，并且在半纯化的基质中更容易区分产物。 

生物共轭分子是新一类或新一代生物分子，通过两种或多种治疗类型分子的组合功能达到更高功效。 生物共轭化学需要细致的过程表征和优化。 微量离心管、烧杯、加热板、磁力搅拌棒和移液管等常规工具不再能够满足有关pH、温度、加样、混合和其他参数的可重现性要求。

生物共轭化学依靠的是一系列控制得当的依次步骤，其中包括官能团还原、活化，API接头与主要生物的共轭以及整个过程中任意数量的洗涤或溶剂或缓冲液交换步骤（请参见下图）。 生物制药科学家正在采用小分子研发过程中使用的方法，例如EasyMax自动合成反应器。 EasyMax可提供统一的体系结构，因此可以精确控制相关的工艺参数，包括pH、电导率、氧化还原、温度、搅拌、加样等，并且可准确捕获实验数据。 生物共轭化学自动化可提供数据整合、工艺事件关联、实验可靠性以及实验设计（DoE）放大生产参数。 

制剂的目的是将来自环境、溶剂或其他物理状态的产物分子转变为适合于人类临床用药的形态。 根据如何通过吸入、注射或口服的方式使用最终产品对产品分子进行制剂。 对产品以及相关赋形剂的长期稳定性进行评估，以确保加工、储存和运输后测得的剂量和关键质量属性（CQA）均在规格范围内。 除了无菌性之外，在蛋白药物制造和长期存储期间，确保去除杂质和内毒素以及防止药品（DP）降解对于保持安全性和功效至关重要。

配制的药物产品包括蛋白质（特别是mAb）、多糖、纳米粒子系统、有机物、寡核苷酸和许多类型的疫苗。 某些疫苗将与佐剂（通常是铝基颗粒或有机乳剂）一起配制。 疫苗制剂与佐剂合成尤其有利于自动化并行反应器工作站、工作流数字化以及正交过程分析技术（PAT）集成。 通过实时PAT，可以获得关于过程中所发生情况的更多信息，而不仅仅是分析起点和终点。

• 发现在生物工艺开发过程中导致瓶颈与杂质形成的原因
• 了解工艺条件对于产品浓度与产量的影响方式
• 最大限度减少效率较低的传统生产和分析技术造成的不准确性和延时
• 监控纯化、色谱、缓冲液交换、上浓缩和制剂等特定操作
• 利用数据挖掘方法充分表征不同下游加工步骤之间的关系，并且利用这些可行信息优化持续过程的性能
• 实施统一的质量源于设计（QbD）/过程分析技术（PAT）策略

本指南阐述了科学家是如何利用过程分析技术（PAT）改变日常工作流程以及明显改进下游过程的。 该应用手册的主题包括：

• 监测蛋白浓度
• 优化缓冲液交换过程
• 疫苗佐剂的成分、分布和形态
• 病毒灭活自动化
• 生物共轭过程开发

生物制药行业正在采用新技术，通过成功应用连续加工方法，以及实现全面的数据捕获和电子记录保管，更多地了解过程。 过程分析技术（PAT）通过自动化实验室反应器、原位光谱分析仪、颗粒表征工具以及高级软件，可以进行精确控制并全面了解，从而实现对下游操作的优化。

• 收获与过滤： ParticleTrack（FBRM）测量进入过滤器或者从过滤器逸出的细胞培养液进料的颗粒积聚和粒度分布，并且可以提供容量相关性或反馈控制，从而最大程度减少过程中断。 EasyViewer进行图像分析，并从时间分辨的过程在线图像中提取粒子堆积、粒度分布和形态。 当EasyViewer放置到过滤器的上方或下方时，可以提供容量相关性或反馈控制，不过在用于根本原因分析、表征和形态分析时最有价值。
  
  
• 初级富集：ReactIR的取样速度和LoD对于初级富集色谱法有利，可在定量区分多个组分的同时在快速事件中记录多个测量点。 监测可变进料输入以及树脂质量与使用性能。 识别和鉴定洗脱液组分，并且避免在接收分析结果方面的延迟，从而实时做出以数据为导向的决策。
  
  
• 缓冲液交换和上浓缩：ReactIR 可实时同时富集和定量多种赋形剂和原料药（DS）。 控制缓冲液使用量；监测膜效应；使用直接原位浓缩而不是径向体积近似；将浓度准确度从+/- 5％提高到+/- 2％；消除分析延迟。 EasyMax自动化反应器通过富集和实验数据结构、精确控制所有关键工艺参数（CPP）以及集成生物物理传感器（例如：pH、电导率、氧化还原和溶解氧（DO）），可将过程开发速度加快高达80％
  
  
• 纯化： ReactIR对于支持精制色谱有利。 定量和形成馏分组分，包括缓冲液、原料药（DS）和杂质。 实时改进馏分、聚合物或碎片的识别度以及总浓度；消除在接收离线分析结果方面的延迟。 当使用 EasyMax进行病毒灭活时，可快速评估实验设计空间，包括混合条件、温度控制、加样策略与速率等。 减轻pH诱导的脱酰胺和变性对质量产生的影响。 通过集成生物物理传感器（例如：pH、电导率、氧化还原和溶解氧）加快工艺开发进程。 通过使用ParticleTrack（FBRM）与EasyViewer，可确定工艺参数对于结晶产生的影响，从而快速优化工艺。
  
  
• 生物共轭（取决于分子）： EasyMax可快速评估和精确控制实验设计空间的关键控制点，包括混合条件、温度控制、加样策略与速率等。 消除离线手动方法以及不良的关键工艺参数控制造成的实验不确定性。 ReactIR与ReactRaman可实时提供详细的机理信息，可避免离线延迟以及取样不准确性。
  
  
• 配方： EasyMax控制所有关键工艺参数，并且集成ReactIR、ReactRaman、ParticleTrack、EasyViewer与多种生物物理传感器。 表征原料药和药物产品的稳定性、最终浓度、佐剂合成、聚合、包封、吸附和其他粒子事件。

EasyMax自动化反应器是在下游加工（DSP）方法设计和实施方面进行基本参数优化的完整工作站。 这套全自动系统可精确控制关键的生物加工变量。

• 管理所有关键工艺参数（CPP），包括试剂与原材料识别、加样、温度、混合、pH测量与滴定
  
  
• 可随时与原位分析方法合用，包括ReactIR（FTIR）、ReactRaman（拉曼）、ParticleTrack（FBRM）、EasyViewer（原位图像分析）与EasySampler。 无需看管即可进行实验；可在需要离线分析时进行智能智能取样。
  
  
• iC Software可自动执行和控制所有实验与外围设备以及全部数据采集与记录保管工作

ReactIR利用中红外光谱对容器或流动工艺流中的水性和有机可溶组分进行原位和实时测量。 ReactIR测量不受悬浮固体、气泡或者细胞质量的影响。

• 原位监测多种产品质量特性。 消除取样延迟
  
  
• 定性加工步骤对于产品产量和工艺效率的影响
  
  
• 为实时决策与控制提供可行的数据分析
  
  
• 通过数据丰富的实验与数字化帮助符合ICH监管准则
  
  
• 从研发到生产全面帮助放大生产
  
  
• 可使用从几毫升到数千升的容量测量低至0.5 mg/mL的分析物浓度

ParticleTrack 与EasyViewer 可帮助科学家进行以下操作：

• 当实验条件发生变化时，持续监测微粒与微粒结构
  
  
• 无需去除样品即可实时跟踪生物系统的批次生长
  
  
• 表征出入操作（例如：过滤）的粒子系统状况
  
  
• 观察粒子机制，例如：佐剂合成、抗原——佐剂吸附和稳定性 

采用聚焦光束反射测量 （FBRM）技术的ParticleTrack是基于探头的 粒子分析仪 ，可直接插入容器内，从而实时跟踪粒度与粒数的变化情况。 利用弦长分布测量获得粒度分布（PSD）。 

EasyViewer 是一种基于探头的光学仪器，可直接插入容器内捕捉粒子系统的图像。 EasyViewer进行图像分析，并从时间分辨的过程在线图像中提取粒子堆积、粒度分布和形态，从而不断确定粒子群的变化趋势。 

Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl₂ precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.

作者称使用了二价阳离子（尤其是ZnCl₂），利用一种基于沉淀的方法对单克隆抗体进行富集和纯化。  由于二价阳离子的交联性质并且消除了PEG，因此上清液的粘度以及再增溶稀释因子非常低。

作者通过使用EasyMax自动化实验室反应器保持ZnCl₂浓度静止以及改变pH值，对pH对产量的影响进行定量分析。 利用ParticleTrack FBRM探头监测沉淀情况，并在不同pH条件下测量蛋白质聚集体的粒度分布。  他们发现沉淀的最佳pH值约为6和7，并且pH对沉淀物聚集体的大小产生重量影响，最大的聚集体产量较高。 他们称FBRM在线监测可用于估算最终产量，无需对沉淀期间的实际浓度进行离线测量。

Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, ”Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using offline and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.

由于抗原和佐剂之间的相互作用对于疫苗的免疫原性很重要，因此在这项研究中，作者研究了佐剂的物理化学性质（在此项研究中为AlPO₄，例如粒度和化学成分。 他们使用了傅立叶变换红外（FTIR）和拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）、激光衍射等离线方法，以及原位FTIR——ATR（ReactIR）、拉曼（ReactRaman）和聚焦光束反射率测量（FBRM，ParticleTrack）等在线方法。 关于在线测量，通过FBRM检查磷酸铝和吸附蛋白的粒度分布，并使用原位ATR探头对磷酸铝进行成分分析。

作者得出的结论是，在线PAT可对佐剂制造的各个阶段有效监测粒度和化学成分。  还可使用类似的方法帮助评估批次之间的一致性。 他们指出，使用在线PAT有助于实施高级生产策略，例如：实时产品放行测试。

以下为最近出版的关于生物技术与生物制药行业下游加工的精选刊物。

• Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl2 precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.
  
• Dhanuka P. Wasalathanthri, Matthew S. Rehmann, Yuanli Song, Yan Gu, Luo Mi, Chun Shao, Letha Chemmalil, Jongchan Lee, Sanchayita Ghose, Michael C. Borys, Julia Ding, Zheng Jian Li, "Technology outlook for real‐time quality attribute and process parameter monitoring in biopharmaceutical development—A review", Biotechnology and Bioengineering (2020), 177(10), 3182-3198.
• Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, "Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using Off-line and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.
• Julian Kager, Vladimir Berezhinskiy , Robert Zimmerleiter, Markus Brandstetter, Christoph Herwig, “Extension of a Particle Filter for Bioprocess State Estimation using Invasive and Non-Invasive IR Measurements”, Computer Aided Chemical Engineering (2019), 46, 1417-1422.
• Matthias Brunner, Philipp Brosig, Monika Losing, Marco Kunzelmann, Amandine Calvet, Fabian Stiefel, Jan Bechmann, Andreas Unsoeld, Jochen Schaub, “Towards robust cell culture processes—Unraveling the impact of media preparation by spectroscopic online monitoring”, Engineering in Life Sciences (2019), 19, 666-680.
• Marine Deshors, Olivier Guais, Virginie Neugnot-Roux, Xavier Cameleyre, Luc Fillaudeau, Jean Marie Francois, "Combined in situ Physical and ex-situ Biochemical Approaches to Investigate in vitro Deconstruction of Destarched Wheat Bran by Enzymes Cocktail Used in Animal Nutrition”, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2019), 7(158).
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