寡核苷酸或寡核苷酸是核酸的短單鏈或雙鏈 片段，它們連接在一起形成單鏈生物聚合物。單個核苷酸鹼基可以被認為是等同於構成經典化學聚合物的單體。 核苷酸由三部分組成： 含氮鹼基、具有五個碳的糖分子（這兩部分是核苷）和 一個或多個磷酸基團。 或者，核苷酸可以由非天然或非規範鹼基組成。常見的例子包括 LNA（鎖定核酸）、 嗎啉和結構修飾的鹼基或骨架。
核苷酸的複雜連接形成了具有生物學關鍵性的 RNA 和 DNA 生物分子。就 RNA 而言，RNA 是一種單鏈生物聚合物，糖是核糖。在 DNA 中，雙鏈分子含有糖脫氧核糖。脫氧核糖核酸和核糖核酸的短序列是重要寡核苷酸的組成部分。這些核苷酸的特定連接產生用於生物、醫學、法醫和臨床應用的目標生物分子。
寡核苷酸可以通過酶促裂解較大的生物分子或通過靶向 化學合成形成。 在後一種情況下，有機核苷酸合成是合成核苷亞磷酰胺（寡核苷酸的關鍵單體元素）的化學過程。核苷亞磷酰胺（也稱為核苷或酰胺酸鹽）本身是天然或合成核苷的衍生物。
因此，核苷酸是由共價連接的核苷和磷酸基團組成的化合物分子。核苷酸以特定順序連接以形成所需的產物。因此，寡核苷酸由連接在一起形成單鏈生物聚合物（“-mers”）的短核酸片段組成。由於大多數寡核苷酸（寡核苷酸）通常由多達 20 個連接的核苷酸組成（儘管可能更多），因此它們可以被認為是小的生物製藥分子。
與其他藥物相關的小分子非常相似，寡核苷酸的合成需要仔細控制溫度、pH 值、底物質量等。由於寡核苷酸合成中使用的典型方法，核苷酸序列越長、越複雜，就越難達到產量、純度和成本目標。過程分析技術 （PAT） 有助於實現這些目標。
寡核苷酸引物和探針
合成寡核苷酸最常見的用途是作為相對較短的探針和引物（高達 30 mer），在各種應用中。這涉及合成與較大的目標 DNA 或 RNA 鏈（目標序列）配對或“反向互補”的核苷酸序列。作為引物，寡核苷酸通常用於啟動酶促反應，例如產生數百萬到數十億個短或長靶序列的拷貝。眾所周知的例子是聚合酶鏈反應 （PCR） 或桑格定序方法。寡核苷酸引物的應用包括DNA定序、基因表達、克隆和分子診斷。
作為探針，寡核苷酸用於識別並結合特定的 DNA 或 RNA 靶序列，以確認該序列在給定材料中的存在。使用寡核苷酸探針的應用包括印跡程序，例如北方印跡（用於 RNA）或南方印跡（用於 DNA），作為微陣列中的熒光團偶聯序列，用於檢測基因表達的變化或用於篩查遺傳疾病或識別特定病原體（分子診斷）。
寡核苷酸治療/基因治療
在治療應用中，反義寡核苷酸 （ASO），通常為 20 至 30 聚體物種，利用自然生物學並促進基因抑制或基因沉默（破壞）不良或過度活躍的 RNA 序列，這反過來又阻斷了某些受損或過度活躍的蛋白質的表達，這些蛋白質可能導致或促進疾病。對寡核苷酸療法的研究得到了極大的加強，近年來已經批准了幾種藥物。
合成核苷酸的未來應用：探索 DNA 和 RNA 疫苗模式
雖然嚴格定義不是寡核苷酸，但基於 DNA 或 RNA 的疫苗產品，例如 mRNA 或質粒或基於載體的核酸，長度為數百或數千個鹼基，代表了不斷發展的合成核苷酸技術的前線。
從概念上講，DNA 或 RNA 疫苗將省去致病菌或病毒的所有不必要或有害部分。相反，這種基於核酸的疫苗僅包含病原體 DNA 或 RNA 的幾部分代碼。這些 DNA 或 RNA 鏈指示患者自己的身體產生病原體的單個抗原或片段，然後促進對抗原的免疫反應。借助現代計算和計算機建模，這些寡核苷酸疫苗模式能夠在幾天或幾週內創建，前提是有適當的目標序列進行設計。作為一種平台技術，基於核酸的疫苗依賴於標準的構建塊或原材料集，幾乎可以隨意實現無數組合。因此，與傳統疫苗方式相比，它們也相對便宜且易於生產。然而，這仍然是生物製藥行業的成熟範式，新的挑戰正在不斷被解決，其中一些是寡核苷酸和長核酸產品所獨有的，有些則與其他生物治療方式共享。
寡核苷酸合成是核苷酸特異性連接以形成所需測序產物的化學過程。使用填充床管柱的連續固相合成通常用於生產寡核苷酸。在某些情況下，採用批量漿料反應。
產生目標低聚物序列的過程需要多個週期，包括特定的合成步驟。第一步，去除固相支持核苷酸上的 4,4' 二甲氧基三酰基保護基團。接下來，亞磷酰胺單體被激活並通過固相結合核苷酸上的游離羥基快速偶聯，以產生含有亞磷酸鹽三酯鍵的二核苷。第三步，亞磷酸鹽三酯被氧化。在最後一步（第一個循環）中，任何未反應的支撐核苷都通過乙酰化“封蓋”，以防止在下一個循環中形成不需要的副產物。
寡核苷酸的長度由構成序列的核苷酸數量定義。就命名法而言，長度為 20 個核苷酸的序列被定義為“20 聚體”。寡核苷酸長度對於不同的應用至關重要。例如，短聚體寡核苷酸通常用於 PCR，而非常長的序列（200 個鹼基或更多）則用於克隆或 CRISPR 編輯等要求苛刻的應用。專門的長聚體寡核苷酸的合成具有挑戰性，提供純序列需要有效的合成控制和純化方法。平均而言，大多數寡核苷酸的長度小於 60 mer。由於寡核苷酸的合成方式需要重複的反應週期來添加額外的核苷酸，因此所需的序列越長，形成不需要的副產物的可能性就越大——其中 可能包括缺失或截斷序列。
根據質量、數量和成本目標使用不同的純化方法。例如，無鹽寡核苷酸去除了化學合成的副產物，但序列失敗仍然存在。從成本和功效的角度來看，這些脫鹽寡核苷酸對於更常規的應用（例如 PCR）很有用。對於要求更高的應用，反相層析法可以從產品中去除不需要的序列，但不如凝膠電泳有效，凝膠電泳可提供高度純化的序列產物，但通常數量有限。特別是對於臨床問題，產量保留也是整個合成和下游加工過程中始終存在的問題。
經典固相化學合成通常涉及使用不受反應條件影響的聚合物或專用玻璃珠。這些珠子可能包含在反應物、試劑和溶劑流過的柱中。珠子的目的是充當底物分子共價結合的平台，然後通過化學反應作用。底物分子上某些官能團的保護和去保護是合成和確保獲得所需產物的關鍵。合成產物通過化學破壞其與底層聚合物珠之間的鍵來去除。
固相合成可有效快速產生純化產物，因為雜質和未反應的材料在合成的各個步驟中都會被洗掉。此外，整個合成適合計算機控制和自動化。固相合成是客製化勝肽和寡核苷酸生產最常用的方法。在後一種情況下，需要多次重複循環來依次添加核苷酸以形成目標序列。
固相寡核苷酸合成面臨許多挑戰，包括隨著鏈長的增加而降低產量。空間位阻通常被假設為一種低屈服機制，其中一條或多條表面固定的鏈可能會干擾其鄰居的每次連續伸長。
為了解決這些和其他挑戰，有多種液相寡核苷酸合成方法。
液相合成的許多基本步驟類似於固相合成。主要區別在於合成發生在溶液或液相中（即不固定在任何表面上）。由於該過程仍然循環進行，因此有幾種隨附的方法可以去除未反應的試劑，同時保留細長的寡核苷酸產物。
使用PCR合成寡核苷酸的技術建立於1985年。1986年，首次使用 Taq 聚合酶 。然而，工業寡核苷酸合成一直難以 採用酶促寡核苷酸合成，主要原因有三個：
能夠使用化學修飾的核苷酸儲備合成 ASO 的工程聚合酶 的研究 和開發 仍在繼續
寡核苷酸合成的複雜性可以受益於更高程度的過程觀察、對反應機制和偏差的理解以及可操作的控制。使用 PAT 進行即時分析可以最大限度地減少或消除耗時或緩慢的離線分析需求。
控制良好的合成環境對於確保反應結果至關重要。自動化反應器平臺同時為所有關鍵過程參數提供信心和一致性。
Rydzak， JW、White， DE、Airiau， CY、Sterbenz， JT、York， BD、Clancy， DJ 和 Dai， Q. （2014）。寡核苷酸流動合成的實時過程分析技術保證。 有機工藝研究與開發，19（1），203-214。
作者指出，儘管自動化固相寡核苷酸合成的方案已經很成熟，但所涉及的化學仍然具有挑戰性且成本高昂。製造中發現的主要風險包括：
未能識別和應對任何這些風險都可能導致流程完全丟失。因此，評估了實時光譜監測與基於中紅外數據的判別、定量和 MSPC 建模相結合的使用。研究發現，ReactIR可以為合成過程帶來實時保證和控制，並能夠改進寡核苷酸的自動化合成。特別是，這種方法的敏感性、信息深度、廣泛的範圍和經驗可及性被認為可以隨時應用於與這些化合物相關的大量關鍵製造挑戰，其中最重要的是在線序列和純度確認。
麥克爾德里，JD，希爾，D.，施密特，E.，蘇，X.，和斯托利，J.（2021）。通過 FTIR 進行在線亞磷酰胺鑑定，以支持實時寡核苷酸序列確認。 有機工藝研究與開發， 25（2）， 262–270。
作者指出，反義寡核苷酸 （ASO） 序列是一個關鍵的質量屬性，必須作為釋放鑑定測試的一部分進行確認。然而，確認全長產物 （FLP） 的身份可能具有挑戰性，因為存在許多可能密切相關的結構。相關結構可能源自於化學反應失敗、與固相底物的意外偶聯、原料製備、劑量和試劑識別錯誤。這些事件中的任何一個都可能導致寡核苷酸聚合物的序列不正確或其他不可接受的品質屬性。
ReactIR 用於模擬和區分流動鑑定和合成中的亞磷酰胺和溶劑。改性亞磷酰胺之間的光譜區分可實現可靠的即時製程驗證，從而能夠在導致序列失敗之前即時發現材料分配中的錯誤。ReactIR 為採取其他方式不可能採取的糾正措施提供了機會。
該方法能夠通過處理實時收集的紅外光譜來識別乙腈溶液中的八種不同的亞磷酰胺。由此產生的模型表現出高靈敏度和特異性，沒有錯誤分類。該模型還展示了對流量變化、儀器間變異性、探針變異性、酰胺溶液濃度和波數偏移的魯棒性。
