Biocatalisi e Catalisi enzimatica

La biocatalisi, o catalisi enzimatica, utilizza componenti biologicamente attivi per catalizzare le trasformazioni chimiche. La biocatalisi facilita uno spettro di reazioni principalmente incentrate sul carbonio in ambienti che vanno da processi privi di cellule, completamente in vitro, a processi mediati dalla fermentazione in colture cellulari viventi.

La biocatalisi rappresenta un'utile alternativa alla catalisi chimica tradizionale per diversi motivi. Reazioni enzimatiche del biocatalizzatore:

• Sono altamente chemio-, regio- ed enantiospecifici
• Spesso hanno una cinetica rapida
• Funzionano in condizioni più miti rispetto ai catalizzatori chimici
• Elimina il problema dei rifiuti, della tossicità e del costo dei catalizzatori metallici
• Ridurre il fabbisogno energetico associato alle reazioni chimiche

L'ingegnerizzazione diretta dei biocatalizzatori migliora la stabilità nei solventi a temperature elevate, consentendo un'ampia adozione della biocatalisi nell'industria farmaceutica, chimica, dei biocarburanti e alimentare.

Scarica questo white paper gratuito per scoprire come la PAT e la scienza dei dati nella ricerca, nello sviluppo e nella produzione di processi di biocatalisi consentono di identificare rapidamente le vie di sintesi non praticabili, le misurazioni delle reazioni cinetiche e lo screening e il controllo dei parametri di processo.

La biocatalisi è associata alla produzione di prodotti chimici "verdi", sostenibili ed economici. Rispetto alla chemiocatalisi, i biocatalizzatori offrono vantaggi intrinseci per la sintesi, tra cui:

• Significativa diversità di composti, sia da fonti naturali che geneticamente modificate, per affrontare un'ampia gamma di trasformazioni chimiche
• Specificità delle reazioni biocatalitiche che mitigano la necessità di specifiche strategie di sintesi/trattamento chimico classico, come l'uso di gruppi bloccanti/debloccanti, la separazione di miscele enantiomeriche e il work-up per rimuovere i sottoprodotti indesiderati
• Semplificazione dell'infrastruttura e dei requisiti delle materie prime poiché molti processi di biocatalisi possono essere eseguiti in reazioni single-pot ed eliminano le fasi di reazione richieste dalla catalisi  chimica tradizionale

Gli enzimi utilizzati nella biocatalisi hanno capacità importanti e frequentemente sfruttate che includono:

A) Legame di gruppo funzionale o sito-specifico e riconoscimento del bersaglio di altri farmaci biologici o piccole molecole

B) Associazione promossa o spostamento di altri farmaci biologici o piccole molecole

C) Caratteristiche strutturali o elettrostatiche che facilitano il trasporto di ioni

D) Ordinato a trasformazioni strutturali disordinate e, quindi, attività catalitiche variate

E) Modificazioni allosteriche o indirette che inducono o sopprimono l'attività enzimatica

La ricerca su biocatalizzatori ricombinanti migliorati o modificati continua ad espandere la loro utilità nella chimica difficile, a migliorare la portata della reazione, la robustezza enzimatica e la riutilizzabilità. I biocatalizzatori naturali e ingegnerizzati sono ora disponibili per eseguire trasformazioni chimiche chiave come la formazione di legami C-C, legami ammidici, la formazione di ammine chirali e la funzionalizzazione C-H.

L'ambito di applicazione degli enzimi utilizzati per le biotrasformazioni è straordinariamente ampio e abbraccia praticamente tutti i settori industriali, tra cui quello alimentare, farmaceutico, tessile, dei biocarburanti, della carta, dei prodotti chimici e dei prodotti per la casa. Nella sintesi di prodotti chimici fini, farmaceutici e intermedi correlati, la biocatalisi (cioè la catalisi enzimatica o catalisi enzimatica) è cresciuta rapidamente come tecnologia abilitante. Gli enzimi sono disponibili per varie biotrasformazioni come ossidazioni, riduzioni, aggiunte ed eliminazioni. 

Le sei principali classi di enzimi ed esempi di applicazione: 

1. Ossidoreduttasi che catalizzano ossidazioni e riduzioni molecolari. Gli enzimi monoossigenasi con ossigeno molecolare consentono la formazione di legami C-O e sono stati ingegnerizzati enzimi specifici per consentire l'ossidazione di alcoli, chetoni, aldeidi e ammine. Per quanto riguarda le riduzioni, le chetoreduttasi (KREDS) e le deidrogenasi consentono la sintesi di alcoli enantiospecifici. Altri enzimi possono ridurre i legami come C=N, trasformando i nitrili in ammine. 

2. Le transferasi sono utili per trasferire gruppi funzionali da una molecola all'altra. La chinasi e le fosfatasi (aggiunta e rimozione di fosfati) sono particolarmente importanti per le cascate di segnalazione molecolare, la replicazione del DNA, la trascrizione dell'RNA e altre funzioni. Ci sono anche molte transferasi biologicamente significative che svolgono funzioni, come la conversione di chetoni o aldeidi in ammine e che possono farlo in modo stereoselettivo.

3. Le idrolasi catalizzano l'idrolisi di vari substrati. Le nucleasi o proteasi sono prolifiche ed essenziali nel riciclaggio degli acidi nucleici e dei peptidi. Le idrolasi come la lipasi, la proteasi e l'acilasi agiscono come catalizzatori per le aggiunte di Michael 1,4, ampiamente utilizzate per formare legami C-C e carbonio-eteroatomo.

4. Le liasi generalmente catalizzano le reazioni attraverso la formazione o l'eliminazione di doppi legami. A differenza di una reazione di sostituzione da parte delle idrolasi, le reazioni carbossilasi o decarbossilasi sono comuni nella biocatalisi farmaceutica per l'aggiunta o la rimozione di CO₂, così come le liasi C-N che possono essere utilizzate per generare amminoacidi tra cui acidi aspartici sostituiti e alanine.

5. Le isomerasi consentono il riarrangiamento degli atomi in una molecola. Le isomerasi, come le racemasi, invertono la stereochimica al carbonio chirale bersaglio, e le isomerasi cis-trans catalizzano l'isomerizzazione degli isomeri cis-trans negli alcheni o nei cicloalcani. La conversione del glucosio in fruttosio tramite glucosio isomerasi rappresenta un'importante biotrasformazione enzimatica industriale.

6. Le ligasi formano nuovi legami chimici unendo due molecole per formare una molecola più grande. Una delle applicazioni più importanti è l'uso della DNA ligasi nella formazione di molecole di DNA ricombinanti e sono il complemento delle endo- o esonucleasi.

Produzione di catalizzatori enzimatici. Generalmente, gli enzimi naturali o ricombinanti per la biocatalisi vengono sintetizzati per la prima volta attraverso fermentazioni, il più delle volte utilizzando batteri, ma occasionalmente derivano da colture di lievito. Sebbene gli enzimi possano essere prodotti in colture cellulari di mammiferi più complesse, i batteri e i lieviti di solito contengono vie molecolari sufficienti e naturalmente presenti per ottenere il ripiegamento e le moderate modifiche post-traduzionali necessarie per gli enzimi biocatalitici ricombinanti. Gli enzimi prodotti attraverso tali fermentazioni vengono solitamente raccolti mediante lisi o altra interruzione delle strutture cellulari per rilasciare gli enzimi ricombinanti e vengono ulteriormente purificati in un processo simile ad altri farmaci biologici Pharmaceuticals. La fermentazione, la raccolta e la lavorazione a valle presentano le proprie sfide che vengono affrontate sfruttando la tecnologia analitica di processo (PAT).

Stabilizzazione e immobilizzazione. L'immobilizzazione enzimatica viene utilizzata per ottenere enzimi più stabili, attivi e riutilizzabili. Generalmente, gli aggregati enzimatici reticolati (CLEA) possono essere formati con diversi substrati solidi come silice, resine o polimeri come PEG e persino altri complessi come le nanoparticelle lipidiche (LNP). Per alcune applicazioni di chimica a flusso, i CLEA possono essere formati anche su superfici e sensori, come quelli utilizzati nelle misure di superficie potenziata per scopi analitici e catalitici. Soluzioni simili per la formulazione dei vaccini e i processi adiuvanti affrontano le sfide della sintesi dei componenti correlati, degli adsorbimenti, delle coniugazioni o di altre associazioni, nonché della stabilità e della formulazione del prodotto.

Cattura e isolamento del prodotto. Dopo la biocatalisi, i CLEA vengono separati dal prodotto e dai reagenti residui e possono quindi essere riciclati o altrimenti conservati. I prodotti a piccole molecole possono quindi essere isolati attraverso filtrazioni o processi cromatografici, sebbene molti processi continuino a favorire i metodi di cristallizzazione. I prodotti di biocatalisi a grandi molecole generalmente continuano con i tradizionali flussi di lavoro di lavorazione a valle.

Comprendere l'emivita pratica e la stabilità di qualsiasi enzima libero, legato al substrato o immobilizzato in superficie può essere fondamentale per la progettazione di protocolli di biocatalisi adeguati. Le considerazioni includono:

• Solventi—Molti enzimi naturali faticano a far fronte alle reazioni dei solventi organici. Un profilo in continua evoluzione di enzimi ingegnerizzati o ricombinanti sta migliorando la compatibilità con le condizioni dei solventi organici. Gli enzimi ricombinanti sono ora in grado di catalizzare reazioni in ambienti di solventi organici, ad esempio, consentendo l'uso di fosforamiditi modificate nella sintesi di oligonucleotidi.
• pH—Gli enzimi generalmente funzionano meglio all'interno di intervalli di pH ristretti e tollerano variazioni di pH <0,5 unità di pH. Pertanto, il controllo del pH è spesso un parametro critico da considerare per molte reazioni biocatalitiche e può essere difficile o noioso da controllare manualmente. 
• Temperatura—Gli enzimi naturali e le loro controparti ricombinanti funzionano in modo efficiente a temperature specifiche con intervalli abbastanza ristretti. Le deviazioni di temperatura possono causare cambiamenti nella cinetica di reazione, nella resa del prodotto o in altri risultati critici del processo.
• Ossigeno disciolto—Questo parametro critico di processo, particolarmente importante per le reazioni di ossigenazione e riduzione, è solitamente controllato dal dosaggio di ossigeno o gas inerte o nello spazio di testa. L'ottimizzazione della quantità e del trasferimento di massa dell'ossigeno disciolto (comprese le caratteristiche delle bolle) nella miscela di reazione è fondamentale per garantire che gli enzimi ossidoreduttasi possano funzionare alla massima efficienza.
• Miscelazione, fluidodinamica e gas—Un corretto apparato di miscelazione può influenzare notevolmente il ciclo di vita degli enzimi biocatalitici, specialmente su lunghe durate, chimica a flusso o cicli di perfusione . Lo scale-up delle reazioni biocatalitiche può essere subottimale se la miscelazione non è sufficientemente caratterizzata. La miscelazione è fondamentale anche per la corretta distribuzione del gas e il trasferimento di massa.
• Stechiometria di reazione—I rapporti corretti tra reagenti ed enzimi sono fondamentali e possono essere determinati da studi di progettazione di esperimenti (DoE), automatizzati da reattori chimici e aiutati da PAT integrati nello sviluppo del processo.

Lo sviluppo e lo scale-up delle reazioni biocatalitiche dipendono dalla natura degli specifici biocatalizzatori utilizzati, dai substrati, dai cofattori e dalle condizioni di reazione applicate. Come nella catalisi chimica, questa matrice complessa e interdipendente di variabili è meglio compresa da un attento controllo delle variabili di reazione se combinata con le informazioni provenienti da misurazioni analitiche in tempo reale. Tuttavia, gran parte delle limitazioni relative allo sviluppo dei processi, allo scale-up e alla densità dei dati per i processi moderni sono legate al continuo orientamento manuale delle reazioni di biocatalisi, che hanno costi significativi in termini di tempo e risorse. Il funzionamento manuale implica la presenza del personale presso il bioreattore per la manutenzione, la regolazione e il campionamento quasi costanti per soddisfare la crescente domanda normativa e istituzionale di caratterizzazione dei processi e trasferimento tecnologico.

Il funzionamento non presidiato della biocatalisi è possibile attraverso piattaforme di automazione di laboratorio che rispondono a condizioni di reazione dinamiche misurate continuamente attraverso sensori integrati e tecnologie analitiche di processo (PAT). Le piattaforme automatizzate dei reattori di sintesi facilitano una sperimentazione più rapida riducendo al minimo l'errore umano o l'intervento. Abbinato al campionamento modulare e automatizzato del reattore per l'analisi cromatografica offline, tutti i parametri critici di processo (CPP) possono essere sovrapposti e analizzati. I dati analitici dei parametri e dei processi vengono registrati automaticamente in tempo reale e strutturati per la gestione e l'archiviazione dei dati. La ridotta variabilità sperimentale e l'aumento della riproducibilità su diverse scale di reattori semplificano ulteriormente lo scale-up basato sull'evidenza.

• I reattori automatizzati EasyMax e OptiMax svolgono un ruolo importante nel garantire che l'effetto delle variabili chiave delle biotrasformazioni, come la temperatura, il pH, le velocità di miscelazione e il dosaggio, sia controllato con precisione, modellato e registrato in modo efficace.
• Le tecnologie spettroscopiche in situ ReactIR e ReactRaman sono utili per tracciare e misurare le specie di reazione chiave in tempo reale. ReactIR tiene traccia degli analiti chiave in soluzione senza interferenze da particelle sospese come le cellule intere.
• ParticleTrack con tecnologia FBRM misura la dimensione e la distribuzione delle particelle in sospensioni eterogenee. EasyViewer acquisisce immagini in situ delle particelle ed esegue analisi delle immagini in tempo reale su torbidità, forma, dimensione, morfologia, conteggio e distribuzioni del sistema.
• EasySampler consente il campionamento completamente automatizzato e non presidiato delle reazioni chimiche, tra cui il quenching e la diluizione dei campioni in preparazione per l'analisi offline.
• Il software di sviluppo dei processi e scale-up Scale-Up Suite consente uno sviluppo rapido, processi ottimali e una scalabilità verticale robusta.

Il reattore automatizzato EasyMax è una workstation completa per l'ottimizzazione dei parametri nella biocatalisi per supportare lo sviluppo, lo scale-up e l'esecuzione. Questo sistema completamente automatizzato consente un controllo preciso dei parametri di processo.

• Gestione dei CPP, tra cui l'identificazione del materiale di partenza, le velocità di dosaggio, la temperatura, l'agitazione, lo spazio di testa, lo sparging, la misurazione del pH e la titolazione
• Si integra facilmente con l'analisi in situ per la biocatalisi, tra cui ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (analisi delle immagini in situ) e EasySampler (campionamento automatizzato del reattore in situ)
• Esegui esperimenti quando non presidiato; Esegui il campionamento automatizzato intelligente quando è richiesta l'analisi offline
• Il software iC consente l'esecuzione e il controllo automatizzati di tutti gli esperimenti e delle apparecchiature periferiche, nonché l'acquisizione completa dei dati e la conservazione dei record

ReactIR utilizza la spettroscopia FTIR per misurare i componenti acquosi e solubili in modo organico negli studi di biocatalisi. Le misurazioni ReactIR non sono influenzate da solidi sospesi, bolle o altre masse di particolato.

ReactRaman utilizza laspettroscopia Raman per fornire analisi molecolari delle particelle e analisi delle reazioni.

• Monitora diversi attributi di qualità del prodotto in situ e in tempo reale in un recipiente o in un flusso di processo che scorre
• Elimina i ritardi associati al prelievo dei campioni
• Quantifica l'impatto delle fasi di lavorazione sulla resa del prodotto e sull'efficienza del processo
• Fornisce analisi dei dati fruibili per il processo decisionale e il controllo in tempo reale
• Supporta le linee guida normative ICH attraverso la sperimentazione e la digitalizzazione ricche di dati
• Aiuta a passare dalla ricerca e sviluppo alla produzione
• Misura concentrazioni di analiti a partire da 500 ppm in volumi da pochi millilitri a migliaia di litri

ParticleTrack utilizza la tecnologia FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement ) ed è uno strumento basato su sonda ottica che viene inserito direttamente in un recipiente per tenere traccia delle variazioni delle dimensioni e del conteggio delle particelle in tempo reale. ParticleTrack utilizza le misure di distribuzione della lunghezza della corda (CLD) per ottenere la distribuzione granulometrica (PSD).

• Le particelle e le strutture delle particelle vengono monitorate continuamente al variare delle condizioni o dei parametri sperimentali
• Caratterizzazione della sintesi di particelle in fase solida, dell'immobilizzazione enzimatica, della scissione e delle morfologie di processo correlate
• Monitoraggio della crescita in batch o in continuo dei prodotti per biocatalisi durante la biocatalisi in tempo reale senza necessità di rimozione del campione
• Caratterizzare le condizioni del sistema di particelle che influenzano la nucleazione, le precipitazioni, il polimorfismo e altri attributi del sistema

EasyViewer è un analizzatore  granulometrico basato su sonda che viene inserito direttamente in un recipiente per acquisire immagini del sistema di particelle. EasyViewer esegue l'analisi delle immagini e misura il numero di particelle, la distribuzione dimensionale e la morfologia da immagini in linea risolte nel tempo del processo, consentendo alle popolazioni di essere classificate nel tempo.

• Le particelle e le strutture delle particelle vengono monitorate continuamente al variare delle condizioni o dei parametri sperimentali
• Caratterizzazione della sintesi di particelle in fase solida, dell'immobilizzazione enzimatica, della scissione e delle morfologie di processo correlate
• Misura del trasferimento di massa (K_La) attraverso la caratterizzazione a bolle
• Monitoraggio della crescita in batch o in continuo dei prodotti di biocatalisi durante la cristallizzazione in tempo reale senza necessità di rimozione del campione
• Caratterizzare le condizioni del sistema di particelle che influenzano la nucleazione, la precipitazione, il polimorfismo e altri attributi del sistema

La progettazione dell'esperimento (DoE) è un mezzo statisticamente utile per ridurre al minimo il numero di esperimenti necessari per esplorare l'effetto delle variabili sulle prestazioni di reazione in laboratorio. Tuttavia, l'aumento dei processi di catalisi enzimatica fino alla produzione è irto di problemi. Ad esempio, molti studi di biocatalisi non considerano variabili come solventi, pH, temperatura e miscelazione nello scale-up. La modellazione Dynochem consente di tenere conto di importanti proprietà fisiche e termiche nello scale-up. Quando le informazioni cinetiche vengono utilizzate con la modellazione Dynochem, è possibile determinare gli endpoint di campionamento adatti per i processi di biocatalisi, risparmiando tempo e risorse. Pertanto, la modellazione Dynochem migliora lo sviluppo dei parametri di processo critici e l'efficace spazio di progettazione del processo.