Trattamento a valle nella biofarmaceutica

Il trattamento biofarmaceutico a valle (detto anche DSP) consiste nel recupero e nella purificazione di una sostanza farmaceutica (DS) da fonti naturali, come cellule animali o batteriche. Il trattamento biofarmaceutico a valle è applicabile ai processi associati a mAb o proteine, oltre che alla produzione di oligonucleotidi, polisaccaridi e vari vaccini.

È generalmente definito come le operazioni unitarie successive al completamento della crescita e dell'espansione cellulare, oltre che alla conclusione della sintesi di una sostanza farmaceutica o della formazione di un altro prodotto. Lo scopo del trattamento a valle è quello di isolare, purificare e concentrare la sostanza farmaceutica precedentemente sintetizzata o un altro prodotto dalla matrice di massa complessa.

Il trattamento a valle può anche includere attività di formulazione, che comportano la transizione da una sostanza farmaceutica a un prodotto farmaceutico (DP). Inoltre, le considerazioni sul trattamento a valle comprendono la gestione di risorse e diversi flussi di rifiuti e materiali biologici. Le attività di trattamento a valle vengono eseguite presso laboratori, impianti pilota e di produzione e coinvolgono i team PAT (Process Analytical Technology) e MSAT (Manufacturing Science and Technology), che si concentrano su ottimizzazione dei processi, scale-up e risoluzione dei problemi. 

A seconda della natura del prodotto e del metodo di sintesi, il trattamento a valle (DSP) include generalmente una combinazione delle seguenti fasi:

• Raccolta e filtrazione
  La raccolta è la prima fase che mira a separare il prodotto dalla massa di detriti, ottimizzando la resa e il mantenimento della qualità
  
  
• Cattura primaria
  Questa espressione si riferisce alla fase in cui si trattiene il prodotto desiderato minimizzando la ritenzione di impurità e sottoprodotti. Differisce dalla "raccolta" per il fatto che tutta la massa di detriti sarà già stata rimossa.
  
  
• Sostituzione delle soluzioni tampone e incremento della concentrazione
  L'ultrafiltrazione (UF) concentra un flusso di prodotti diluiti e separa le molecole in soluzione in base alle dimensioni dei pori della membrana o al limite del peso molecolare. La diafiltrazione (DF) sostituisce i prodotti da una soluzione tampone esistente a una nuova per un processo successivo o una formulazione finale. Insieme, ultrafiltrazione (UF) e diafiltrazione (DF) sono le fasi della sostituzione delle soluzioni tampone.
  
  
• Purificazione (ed eliminazione di contaminanti o impurità)
  La purificazione rimuove le impurità residue con ogni metodo successivo impiegato, conservando inoltre quanto più prodotto possibile. L'obiettivo è quello di ottenere un prodotto puro riducendo al minimo la potenziale perdita in termini di resa.
  
  
• Bioconiugazione (dipendente dalle molecole)
  Le molecole di bioconiugati sono una nuova classe o generazione di molecole biologiche. Sono progettate in modo tale da offrire una maggiore efficacia grazie alla funzione combinata di due o più differenti tipologie terapeutiche di molecole. I coniugati anticorpo-farmaco (ADC) sono tra i bioconiugati più comuni e vengono sintetizzati mediante la modifica biochimica di un anticorpo e la creazione di un legame covalente tra esso e un altro principio attivo farmaceutico (API).
  
  
• Formulazione
  La formulazione è il processo con cui una sostanza farmaceutica (DS) si trasforma in un prodotto farmaceutico (DP) formulato. La formulazione porta la molecola del prodotto da un ambiente, solvente o altro stato fisico a un formato adeguato alla somministrazione clinica.

• Filtrazione di profondità, a fibre cave: a seconda della natura del prodotto e del processo, i metodi di raccolta solitamente includono l'impiego della filtrazione di profondità (immagine 1) o di filtri a fibre cave (immagine 2). Con la filtrazione di profondità, una miscela viene pompata attraverso una membrana o un'altra interfaccia per separare i detriti dal prodotto in sospensione liquida. I filtri a fibre cave vengono impiegati nei processi di biotrattamento continui per rimuovere la sostanza farmaceutica (DS) espressa dal surnatante e intrappolare temporaneamente una parte della biomassa. Quella del frazionamento campo acustico-flusso è un'altra tecnica emergente al momento impiegata soprattutto negli ambienti di sviluppo. Con varie modalità di funzionamento e configurazione, gli esiti possono:
  • Non modulare alcuna separazione di cellule o particelle (immagine 3a)
  • Selezionare la separazione di cellule o particelle dai flussi di alimentazione e il trasferimento in un nuovo flusso di cattura con deviazione o separazione di una seconda popolazione di particelle (immagine 3b)
  • Trasferire un intero sistema di particelle in un nuovo flusso e/o in una riallocazione dei fluidi, possibilmente in ricircolo (immagine 3c)
  • Interagire idrodinamicamente, laddove potrebbe presentarsi una miscela modulata composta dalla selezione di particelle e dallo scambio di fluidi (immagine 3d)

• Centrifugazione: un altro metodo di separazione ampiamente impiegato nel biotrattamento; tuttavia, con l'affermarsi del trend che favorisce una biomassa totale da alta a molto alta e una moderata densità finale delle cellule vitali, la centrifugazione è più spesso vista come un collo di bottiglia e non ampiamente considerata pratica per il biotrattamento continuo.
  
  
• Lisi acidi/tensioattivi, assorbimento in fase organica: la separazione del prodotto mediante lisi mira solitamente a un obiettivo fondamentale, ovvero separare efficacemente le strutture sequestranti contenenti la sostanza farmaceutica o il prodotto e creare una separazione fisica tra gli eventuali detriti o altre impurità e la sostanza farmaceutica stessa. La lisi di acidi o tensioattivi viene quasi esclusivamente utilizzata con sistemi d'espressione come batteri e, occasionalmente, lieviti. Allo stesso modo, l'assorbimento in fase organica e la cattura di un prodotto è più comune tra i sistemi di espressione e produzione batterica ed viene occasionalmente impiegato per i lieviti.
  
  
• Flocculazione e precipitazione: si tratta di metodi di manipolazione dei sistemi di particelle attive per raggiungere l'obiettivo della separazione. La flocculazione viene generalmente applicata come metodo di preparazione prima della filtrazione o della centrifugazione. Con la flocculazione è possibile garantire un flusso elevato nelle unità di filtrazione e una separazione efficace del materiale cellulare dal surnatante. Potrebbero essere necessari ulteriori metodi di rimozione dei flocculanti e protocolli di verifica. La precipitazione è una manipolazione delle particelle attive innescata dalla variazione dei parametri, come solvente, forza ionica per ridurre la solubilità.
  

La distribuzione granulometrica delle particelle (PSD) viene considerata come un parametro critico di processo (CPP) associato alla capacità del filtro e ha un impatto molto maggiore rispetto all'impiego esclusivo di torbidità e pressione. La distribuzione granulometrica delle particelle (PSD) può essere integrata nel tempo per mappare l'accumulazione delle particelle sui filtri (sonda sopra il filtro) e prevedere i guasti. La distribuzione granulometrica delle particelle può anche essere misurata sotto il filtro per osservare la penetrazione di tracce di particolato e identificare eventi simili.

Il metodo e la strategia di cattura variano leggermente a seconda della natura della molecola target. Gli anticorpi vengono principalmente catturati con resine di affinità come proteina A e proteina G e con altri metodi selettivamente ingegnerizzati. Le proteine diverse dagli anticorpi e gli oligonucleotidi vengono più spesso catturati tramite cromatografia a scambio ionico (IEX). Prodotti come polisaccaridi e strutture di glicani complessi vengono spesso catturati tramite cromatografia a interazione idrofobica (HIC) o cromatografia in fase inversa (RPC).

• La cromatografia di affinità (proteina A/G) è un metodo cromatografico di primo passaggio (solitamente chiamato proteina A o ProA) che separa e concentra il prodotto di interesse (solitamente un mAb) da altri materiali solubili legando reversibilmente o trattenendo la proteina target alla colonna tramite specifiche interazioni vincolanti (immagine a) mentre gli altri componenti "eluiscono" dalla colonna (immagine b). Una serie di fasi di lavaggio seguite da un'eluizione selettiva permettono quindi il rilascio della molecola target (immagine c). Quando si usa la cromatografia di affinità sorgono alcuni problemi, come ad esempio l'ottimizzazione del legame della proteina target (carica della colonna) alla colonna di affinità. Molti di questi problemi vengono attualmente superati grazie ai sistemi UV integrati, che soddisfano i requisiti correnti pur non offrendo le capacità associate a metodi come la spettroscopia FTIR in-situ.
  
  
• La cromatografia a scambio ionico (IEX) separa e concentra il prodotto di interesse (proteine, oligonucleotidi e altri) da altri materiali solubili legando reversibilmente o trattenendo la molecola target alla colonna in base alla forza dell'interazione elettrostatica con il materiale in fase solida (immagine d) mentre gli altri componenti "eluiscono" dalla colonna. La cromatografia a scambio ionico (IEX) viene regolarmente impiegata come metodo di purificazione aggiuntivo o alternativo e pertanto non limitato alle applicazioni di cattura.

L'ultrafiltrazione (UF) viene frequentemente impiegata nei biotrattamenti a valle per la concentrazione di un flusso di prodotto diluito. L'ultrafiltrazione (UF) separa le molecole all'interno di una soluzione in base alle dimensioni dei pori della membrana o al limite del peso molecolare. La diafiltrazione (DF) viene usata più spesso per scambiare il prodotto in una soluzione tampone desiderata (ad esempio da una soluzione tampone di eluizione a una per la formulazione finale).

• Ultrafiltrazione e diafiltrazione (insieme note come sostituzione delle soluzioni tampone) impiegano solitamente la filtrazione a flusso tangenziale (TFF), che prevede uno scorrimento parallelo piuttosto che perpendicolare alla superficie della membrana. La sostituzione delle soluzioni tampone resta un'operazione estremamente manuale che viene raramente ottimizzata. La concentrazione del prodotto viene generalmente analizzata con una forma di spettroscopia UV, sia indipendente, come un rivelatore per HPLC, o come metodo per lunghezze di cammino variabili.

Sono numerose le criticità che sorgono nel processo di sostituzione delle soluzioni tampone:

• Monitoraggio accurato dei volumi degli scambi
• Previsione sicura del processo da campioni prelevati non rappresentativi
• Ritardi o colli di bottiglia nei tempi di risposta delle misure offline
• Perdita cumulativa di prodotto con il campionamento estrattivo
• Propagazione degli errori nella preparazione dei campioni per le misure UV e HPLC offline
• La spettroscopia Raman e IR in-situ consentono di analizzare simultaneamente più componenti, con maggiore accuratezza e intervallo dinamico più ampio e senza i ritardi associati all'analisi offline. 

Esistono diversi metodi impiegati in sequenza per aumentare la purezza della sostanza farmaceutica (DS), a partire dalle fasi preliminari di chiarificazione ed estrazione, seguite da un appropriato processo di cattura e dal primo isolamento di massa e, successivamente, dalle fasi intermedie e finali della purificazione; queste ultime comprendono uno stadio cromatografico di affinamento, nanofiltrazione/filtrazione sterile, cristallizzazione e inattivazione virale.

Eliminando i ritardi associati all'analisi offline, le misure FTIR in-situ migliorano lo stadio cromatografico di affinamento fornendo un feedback immediato per quantificare ed effettuare la speciazione dei componenti delle frazioni, tra cui soluzioni tampone, sostanza farmaceutica e impurità, durante le fasi intermedie di purificazione. Ciò determina un miglioramento nelle suddivisioni delle frazioni, nella distinzione di aggregati o frammenti e nella concentrazione totale in tempo reale. Per l'inattivazione virale, qualsiasi virus presente nella sospensione terapeutica in pool e semi-purificata viene intenzionalmente distrutto o reso di colpo non patogeno, di solito mediante l'alterazione dell'ambiente attorno a esso. Il controllo e il perfezionamento di questi parametri critici di processo (CPP) è consentito da piattaforme di reattori automatiche con sensori biofisici integrati. La tecnologia analitica di processo (PAT) in linea è utile per caratterizzare le impurità nelle fasi successive della purificazione, dato che le concentrazioni sono generalmente più elevate ed è più semplice distinguere il prodotto in una matrice semi-purificata. 

Le molecole di bioconiugati sono una nuova classe o generazione di molecole biologiche, progettate in modo tale da offrire una maggiore efficacia grazie alla funzione combinata di due o più differenti tipologie terapeutiche di molecole. La chimica dei bioconiugati richiede una caratterizzazione e un'ottimizzazione dettagliate dei processi. Gli strumenti convenzionali come provette per microcentrifughe, becher, fornelli, agitatori magnetici e pipette di trasferimento non sono in grado di soddisfare le esigenze di riproducibilità rispetto a pH, temperatura, dosaggio, miscelazione e altri parametri.

La chimica di bioconiugazione fa affidamento su una serie di passaggi adeguatamente controllati in sequenza che possono includere riduzione di gruppi funzionali, attivazione, coniugazione di linker API al biofarmaco primario e tutte le varie fasi di lavaggio o sostituzione di solvente o soluzione tampone (vedere il diagramma seguente). I ricercatori in ambito biofarmaceutico stanno adottando una metodologia usata per la R&S di piccole molecole, come i reattori automatici di sintesi EasyMax. I reattori EasyMax offrono una struttura che permette di controllare attentamente i parametri rilevanti del processo, come pH, conducibilità, redox, temperatura, agitazione, dosaggio, ecc., oltre a raccogliere i dati degli esperimenti. L'automazione della chimica di bioconiugazione offre integrazione dei dati, correlazione degli eventi del processo, affidabilità procedurale e parametri di scale-up per la progettazione degli esperimenti (DoE). 

L'obiettivo della formulazione è portare la molecola del prodotto da un ambiente, solvente o altro stato fisico a un formato adeguato alla somministrazione clinica. La molecola viene formulata in base al modo in cui verrà usato il prodotto finale, tramite inalazione, iniezione o somministrazione orale. La stabilità a lungo termine del prodotto e degli eccipienti associati viene valutata per garantire che la dose misurata e gli attributi di qualità critici (CQA) rientrino nelle specifiche a seguito di trattamento, conservazione e spedizione. Oltre alla sterilità, garantire la rimozione di impurità ed endotossine e prevenire la degradazione del prodotto farmaceutico (DP) è essenziale per mantenere la sicurezza e l'efficacia durante la produzione e la conservazione a lungo termine di un farmaco proteico.

I prodotti farmaceutici formulati includono proteine (nello specifico mAb), polisaccaridi, sistemi di nanoparticelle, sostanze organiche, oligonucleotidi e numerose tipologie di vaccini. Alcuni vaccini saranno formulati con un coadiuvante, solitamente un particolato a base di alluminio o un'emulsione organica. La formulazione del vaccino e la sintesi del coadiuvante in particolare sono workflow ben posizionati per sfruttare workstation di reattori paralleli automatici, digitalizzazione dei workflow e integrazione della tecnologia analitica di processo (PAT) ortogonale. Grazie alla PAT in tempo reale, si ottengono molte più informazioni su ciò che accade durante il processo, invece di analizzare solo i punti iniziali e finali.

• Identificate i fattori che contribuiscono alla formazione di colli di bottiglia e impurità durante lo sviluppo di biotrattamenti
• Determinate il modo in cui le condizioni di svolgimento dei processi hanno conseguenze sulla concentrazione e sulla resa del prodotto
• Riducete al minimo le inaccuratezze e i ritardi derivanti da tecniche di produzione e analisi tradizionali e meno efficienti
• Monitorate operazioni specifiche come purificazione, cromatografia, sostituzione delle soluzioni tampone, incremento della concentrazione e formulazione
• Utilizzate metodi di data mining per caratterizzare completamente la relazione tra la varie fasi del trattamento a valle e sfruttate queste utili informazioni per ottimizzare le prestazioni dei processi continui
• Implementate una strategia che integri l'approccio Quality by Design (QbD)/la tecnologia analitica di processo (PAT)

Questa guida spiega come gli scienziati stanno utilizzando la tecnologia analitica di processo (PAT) per trasformare i workflow di tutti i giorni e apportare miglioramenti significativi ai processi a valle. Argomenti trattati:

• Monitoraggio della concentrazione di proteine
• Ottimizzazione del processo di sostituzione delle soluzioni tampone
• Composizione, distribuzione e morfologia dei coadiuvanti per i vaccini
• Automazione dell'inattivazione virale
• Sviluppo del processo di bioconiugazione

L'industria biofarmaceutica sta adottando una nuova tecnologia per ottenere maggiori informazioni sui processi applicando con successo i metodi di trattamento continuo e consentendo l'acquisizione di dati completi e il loro monitoraggio elettronico. Grazie a reattori di laboratorio automatici, analizzatori spettroscopici in-situ, strumenti di caratterizzazione delle particelle e un software avanzato, la tecnologia analitica di processo (PAT) assicura un controllo accurato e una comprensione completa per l'ottimizzazione delle operazioni a valle.

• Raccolta e filtrazione: ParticleTrack (FBRM) misura l'accumulo di particelle e la distribuzione granulometrica dal flusso di coltura cellulare che entra o esce dai filtri e può fornire correlazione tra capacità o controllo tramite feedback per ridurre al minimo i tempi di fermo del processo. EasyViewer esegue l'analisi delle immagini del processo in linea risolte nel tempo ed estrapola informazioni su accumulo delle particelle, distribuzione granulare e morfologia. Posizionato sopra o sotto i filtri, EasyViewer è in grado di offrire correlazione tra capacità o controllo tramite feedback, ma è più utile quando viene applicato ad analisi della causa primaria, caratterizzazione e morfologia.
  
  
• Cattura primaria: le velocità di campionamento e LoD di ReactIR sono vantaggiose per la cromatografia della cattura primaria, perché registrano diversi punti di misura nell'ambito di eventi rapidi operando una differenziazione quantitativa tra più componenti. Monitorate gli input di alimentazione variabili, oltre alla qualità della resina e l'inalterabilità delle prestazioni. Identificate e tipizzate i componenti degli eluati ed eliminate i ritardi nella ricezione dei risultati analitici per prendere decisioni basate sui dati in tempo reale.
  
  
• Sostituzione delle soluzioni tampone e incremento della concentrazione: ReactIR raccoglie e quantifica diversi eccipienti e specie di sostanze farmaceutiche (DS) simultaneamente in tempo reale. Controllate l'uso delle soluzioni tampone, monitorate gli effetti delle membrane, utilizzate la concentrazione diretta in-situ piuttosto che approssimazioni di diavolumi, aumentate l'accuratezza delle concentrazioni da +/-5% a +/-2% ed eliminate i ritardi nelle analisi. I reattori automatici EasyMax accelerano lo sviluppo dei processi fino all'80% attraverso l'acquisizione e l'organizzazione dei dati sperimentali, il controllo accurato di tutti i parametri critici di processo (CPP) e l'integrazione dei sensori biofisici come quelli di pH, conducibilità, redox e ossigeno disciolto (DO)
  
  
• Purificazione: ReactIR è utile per supportare lo stadio cromatografico di affinamento. Quantificate ed effettuate la speciazione dei componenti delle frazioni, tra cui soluzioni tampone, sostanza farmaceutica (DS) e impurità. Migliorate le suddivisioni delle frazioni, la distinzione di aggregati o frammenti e la concentrazione totale in tempo reale ed evitate ritardi nella ricezione dei dati analitici offline. Con EasyMax applicato all'inattivazione virale, valutate rapidamente lo spazio di DoE, tra cui le condizioni di miscelazione, il controllo della temperatura, le strategie e le velocità di dosaggio. Mitigate gli effetti sulla qualità della denaturazione o della deamidazione indotte dal pH. Accelerate lo sviluppo dei processi mediante l'integrazione di sensori biofisici come quelli per pH, conducibilità, redox e ossigeno disciolto. Con ParticleTrack (FBRM) e EasyViewer viene determinato l'impatto dei parametri del processo sulla cristallizzazione per un'ottimizzazione rapida.
  
  
• Bioconiugazione (dipendente dalle molecole): EasyMax consente una valutazione rapida e un controllo ottimale dei CPP dello spazio di DoE, tra cui le condizioni di miscelazione, il controllo della temperatura, le strategie e le velocità di dosaggio. Eliminate la variabilità degli esperimenti associata ai metodi manuali offline e a controlli inadeguati dei parametri critici di processo. ReactIR e ReactRaman forniscono informazioni dettagliate e in tempo reale sulla meccanica, eliminando i ritardi offline e le inaccuratezze del campionamento.
  
  
• Formulazione: EasyMax controlla tutti i parametri critici del processo e integra ReactIR, ReactRaman, ParticleTrack, EasyViewer e numerosi sensori biofisici. Caratterizzate la stabilità della sostanza e del prodotto farmaceutici, la concentrazione finale, la sintesi dei coadiuvanti, le polimerizzazioni, l'incapsulamento, gli adsorbimenti e altri eventi legati al particolato.

Il reattore automatico EasyMax è una workstation completa per l'ottimizzazione dei parametri fondamentali nella progettazione e nell'esecuzione di metodi di trattamento a valle (DSP). Questo sistema completamente automatico offre un controllo accurato sulle variabili chiave dei biotrattamenti.

• Consente di gestire tutti i parametri critici di processo (CPP), compresi l'identificazione, il dosaggio, la temperatura, la miscelazione, la misura di pH e la titolazione di reagenti e materiale di approvvigionamento.
  
  
• Si integra facilmente con gli strumenti per la metodologia di analisi in-situ, tra cui ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (analisi delle immagini in-situ) e EasySampler. Eseguite automaticamente gli esperimenti e il campionamento automatico intelligente quando è richiesta l'analisi offline.
  
  
• iC Software offre esecuzione e controllo automatici di tutti gli esperimenti e strumenti periferici, oltre alla completa acquisizione e tracciabilità dei dati.

ReactIR utilizza la spettroscopia nel medio infrarosso per misurare sia i componenti acquosi che quelli organici solubili in un recipiente o nel flusso di processo, in-situ e in tempo reale. Le misure di ReactIR non sono influenzate da solidi in sospensione, bolle o massa cellulare.

• Monitorate diversi attributi di qualità dei prodotti in-situ. Eliminate i ritardi associati ai campioni prelevati
  
  
• Quantificate l'impatto delle fasi di trattamento sulla resa del prodotto e sull'efficienza del processo
  
  
• Fornisce analisi di dati utili per decisioni e controllo in tempo reale
  
  
• Supporta le linee guida delle normative ICH grazie alla raccolta di grandi quantità di dati e alla digitalizzazione
  
  
• Supporta lo scale-up dalla fase di R&S fino alla produzione
  
  
• Misura concentrazioni di analita fino a 0,5 mg/ml in volumi da pochi millilitri a migliaia di litri

ParticleTrack e EasyViewer permettono ai ricercatori di:

• Monitorare continuamente le particelle e le relative strutture al variare delle condizioni degli esperimenti
  
  
• Monitorare la crescita dei lotti di sistemi biologici in tempo reale senza la necessità di rimozione del campione
  
  
• Caratterizzare le condizioni dei sistemi di particelle in entrata o in uscita nell'ambito di operazioni come la filtrazione
  
  
• Osservare i meccanismi delle particelle come la sintesi dei coadiuvanti, l'assorbimento e la stabilità di antigeni-coadiuvanti 

ParticleTrack con tecnologia FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement) è un analizzatore di particelle basato su sonda che viene inserito direttamente in un recipiente per monitorare la variazione delle dimensioni e del numero di particelle in tempo reale. Utilizza le misure della distribuzione della lunghezza di corda per ottenere la distribuzione granulometrica delle particelle (PSD). 

EasyViewer è uno strumento ottico basato su sonda che viene inserito direttamente in un recipiente per acquisire immagini del sistema di particelle. EasyViewer esegue l'analisi delle immagini del processo in linea risolte nel tempo ed estrapola informazioni su accumulo delle particelle, distribuzione granulare e morfologia, che consentono di determinare di volta in volta i trend associati alle popolazioni. 

Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl₂ precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.

Gli autori riportano l'uso di cationi bivalenti, nello specifico ZnCl₂, per catturare e purificare gli anticorpi monoclonali con un metodo basato sulla precipitazione.  Data la natura di crosslinking dei cationi bivalenti e l'eliminazione di PEG, la viscosità dal surnatante e i fattori di diluizione della risolubilizzazione sono apparsi molto contenuti.

Mantenendo la concentrazione di ZnCl₂ statica e variando il pH mediante l'uso del reattore di laboratorio automatico EasyMax, gli autori hanno quantificato gli effetti del pH sulle rese. La precipitazione è stata monitorata con una sonda ParticleTrack FBRM, mentre la distribuzione granulare dei cluster di proteine è stata misurata a pH diversi.  È stato riscontrato che il pH ottimale per la precipitazione è attorno a 6 e 7 e che il pH ha un importante impatto sulla dimensione dei cluster di precipitato, i più grandi dei quali sono associati alle rese superiori. Gli autori affermano che il monitoraggio in linea con la tecnologia FBRM può essere impiegato per valutare le rese ottenute senza la misura offline dell'effettiva concentrazione durante la precipitazione.

Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, ”Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using offline and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.

Dato che l'interazione tra l'antigene e il coadiuvante è importante per l'immunogenicità dei vaccini, in questa ricerca gli autori hanno esaminato le proprietà fisico-chimiche del coadiuvante, in questo caso AlPO₄, come dimensioni delle particelle e composizione chimica. Sono state impiegate sia tecniche offline come la spettroscopia ad infrarossi a trasformata di Fourier (FTIR) e Raman, la spettroscopia fotoelettronica a raggi-X (XPS) e la diffrazione laser, sia metodi in linea come FTIR-ATR (ReactIR) in-situ, Raman (ReactRaman) e FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement, ParticleTrack). Rispetto alle misure in linea, la distribuzione granulometrica del fosfato di alluminio e la proteina adsorbita sono state esaminate con la tecnologia FBRM, mentre l'analisi della composizione del fosfato di alluminio è stata eseguita con la sonda ATR in-situ.

Gli autori hanno concluso che la PAT in linea monitora efficacemente le dimensioni e la composizione chimica delle particelle per le varie fasi della produzione del coadiuvante.  Approcci simili possono essere impiegati per contribuire a valutare anche l'uniformità fra i lotti. Gli autori affermano che l'uso della PA in linea supporta strategie di produzione avanzate come la verifica in tempo reale del rilascio dei prodotti.

Di seguito è riportata una selezione di pubblicazioni recenti sul trattamento a valle nella biotecnologia e nel settore biofarmaceutico.

• Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl2 precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.
  
• Dhanuka P. Wasalathanthri, Matthew S. Rehmann, Yuanli Song, Yan Gu, Luo Mi, Chun Shao, Letha Chemmalil, Jongchan Lee, Sanchayita Ghose, Michael C. Borys, Julia Ding, Zheng Jian Li, "Technology outlook for real‐time quality attribute and process parameter monitoring in biopharmaceutical development—A review", Biotechnology and Bioengineering (2020), 177(10), 3182-3198.
• Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, "Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using Off-line and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.
• Julian Kager, Vladimir Berezhinskiy , Robert Zimmerleiter, Markus Brandstetter, Christoph Herwig, “Extension of a Particle Filter for Bioprocess State Estimation using Invasive and Non-Invasive IR Measurements”, Computer Aided Chemical Engineering (2019), 46, 1417-1422.
• Matthias Brunner, Philipp Brosig, Monika Losing, Marco Kunzelmann, Amandine Calvet, Fabian Stiefel, Jan Bechmann, Andreas Unsoeld, Jochen Schaub, “Towards robust cell culture processes—Unraveling the impact of media preparation by spectroscopic online monitoring”, Engineering in Life Sciences (2019), 19, 666-680.
• Marine Deshors, Olivier Guais, Virginie Neugnot-Roux, Xavier Cameleyre, Luc Fillaudeau, Jean Marie Francois, "Combined in situ Physical and ex-situ Biochemical Approaches to Investigate in vitro Deconstruction of Destarched Wheat Bran by Enzymes Cocktail Used in Animal Nutrition”, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2019), 7(158).
• Steffen Großhans, Matthias Rüdt, Adrian Sanden, Nina Brestrich, Josefine Morgenstern, Stefan Heissler, Jürgen Hubbuch, “In-line Fourier-transform infrared spectroscopy as a versatile process analytical technology for preparative protein chromatography", Journal of Chromatography A, (2018), 1547, 37-44.
• Anja Lemoinea, Frank Delvigneb, Anika Bockischa, Peter Neubauera, Stefan Junne, “Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions”, Journal of Biotechnology (2017), 251, 84-93.
• Anouk Dirksen, Keith A. Davis, Joe T. Collins, Keshab Bhattacharya, Jari I. Finneman, Erin L. Pepin, Jeffrey S. Ryczek, William B. Wellborn, Ratish Mangalathillam, Brad P. Evans, Mark J. Pozzo, Rory F. Finn, “Process development of a FGF21 protein–antibody conjugate”, Peptide Science (2017), 110:e23042.
• Cosima Koch, Andreas E. Posch, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Comparison of Fiber Optic and Conduit Attenuated Total Reflection (ATR) Fourier Transform Infrared (FT-IR) Setup for In-Line Fermentation Monitoring”, Applied Spectroscopy (2016), 70(12), 1965-1973.
• Andrew Salazar, Julia Bleifuß, Anke Simon, Sabrina Schüßler, Michael Keusgen, Nikolai Stankiewicz, Jörg von Hagen, “Compaction of chemically defined cell culture media increases its dissolution rate through an increase of solvent accessible surface area”, Powder Technology (2016), 301, 110-117.
• Patricio Lopez-Exposito, Angeles Blanco Suarez, Carlos Negro, “Estimation of Chlamydomonas reinhardtii biomass concentration from chord length distribution data”, Journal of Applied Phycology (2016), 28, 2315–2322.
• Christian Sieblist, Marco Jenzsch, Michael Pohlscheidt, “Equipment characterization to mitigate risks during transfers of cell culture manufacturing processes”, Cytotechnology (2016), 68(4), 1381–1401.
• Cosima Koch, Markus Brandstetter, Patrick Wechselberger, Bettina Lorantfy, Maria Reyes Plata, Stefan Radel, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Ultrasound-Enhanced Attenuated Total Reflection Mid-Infrared Spectroscopy In-Line Probe: Acquisition of Cell Spectra in a Bioreactor”, Analytical Chemistry (2015), 87, 2314−2320.
• Janosch Fagaschewski, Daniel Sellin, Charles Wiedenhöfer, Sven Bohne, Hoc K. Trieu, Lutz Hilterhaus, “Spatially resolved in situ determination of reaction progress using microfluidic systems and FT-IR spectroscopy as a tool for biocatalytic process development”, Bioprocess Biosystems Engineering (2015), 38, 1399–1405.
• Huiquan Wu, Erik Read, Maury White, Brittany Chavez, Kurt Brorson, Cyrus Agarabi, Mansoor Khan, “Real time monitoring of bioreactor mAb IgG3 cell culture process dynamics via Fourier transform infrared spectroscopy: Implications for enabling cell culture process analytical technology”. Frontiers of Chemical Science and Engineering (2015), 9, 386–406.
• Cosima Koch, Andreas Posch, Héctor Goicoechea, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Multi-analyte quantification in bioprocesses by Fourier-transform-infrared spectroscopy by partial least squares regression and multivariate curve resolution”, Analytica Chimica Acta (2014), 807, 103-110.
• Cornelia Walther, Sabrina Mayer, Alois Jungbauer, Astrid Dürauer, “Getting ready for PAT: Scale up and inline monitoring of protein refolding of Npro fusion proteins”, Process Biochemistry (2014), 49(7), 1113-1121.
• Anne Tscheliessnig, Peter Satzer, Nikolaus Hammerschmidt, Henk Schulz, Bernhard Helk, Alois Jungbauer, “Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies”, Journal of Biotechnology (2014), 188, 17-28.
• Patrick Sagmeister , Magdalena Kment , Andrea Meitz , Timo Langemann, Christoph Herwig, “Soft-sensor assisted dynamic investigation of mixed feed bioprocesses”, Process Biochemistry (2013), 48(12), 1839-1847.
• Patrick Sagmeister, Timo Langemann, Patrick Wechselberger, Andrea Meitz, Christoph Herwig, “A dynamic method for the investigation of induced state metabolic capacities as a function of temperature”, Microbial Cell Factories (2013), 12, 94.
• John Dahlbacka , Kristiina Kiviharju, Tero Eerikäinen, Kaj Fagervik, “Monitoring of Streptomyces peucetius cultivations using FTIR/ATR spectroscopy and quantitative models based on library type data”, Biotechnology Letters (2013), 35, 337–343.
• John Dahlbacka, Jan Weegar, Niklas von Weymarn, Kaj Fagervik, “On-line measurement of the substrate concentrations in Pichia pastoris fermentations using FT-IR/ATR”. Biotechnology Letters (2012), 34, 1009–1017.
• Daniel Landgrebe, Claas Haake, Tim Höpfner, Sascha Beutel, Bernd Hitzmann, Thomas Scheper, Martin Rhiel, Kenneth F. Reardon, “On-line infrared spectroscopy for bioprocess monitoring”, Applied Microbiology and Biotechnology (2010), 88, 11–22.
• Michal Dabros, Moira Monika Schuler, Ian W. Marison, “Simple control of specific growth rate in biotechnological fed-batch processes based on enhanced online measurements of biomass”, Bioprocess Biosystems Engineering (2010), 33(9), 1109-1118.
• Jakob J. Müller, Markus Neumann, Paul Scholl, Lutz Hilterhaus, Marrit Eckstein, Oliver Thum, Andreas Liese, “Online Monitoring of Biotransformations in High Viscous Multiphase Systems by Means of FT-IR and Chemometrics”, Analytical Chemistry (2010), 82(14), 6008–6014.