生物加工中的病毒滅活

病毒滅活通常是旨在提高生物治療產品安全性的兩個專用步驟中的第一個。在滅活過程中，混合和半純化的治療懸浮液中存在的任何病毒都會被故意破壞或突然變得非致病性，通常是通過改變病毒周圍的環境來導致病毒結構的不可逆轉的破壞和變性。

通常，這是通過改變病毒周圍的環境來導致病毒結構的不可逆轉的破壞和變性來完成的——例如，通過化學、物理甚至能量方法。病毒清除與病毒滅活是分開的，因為它是一個互補過程，通過消除或將病毒與感興趣的蛋白質或產物分離來進一步提高病毒安全性。

許多生物治療產品在生產或加工過程中含有病毒或可能被病毒污染。這些方式中的致病性和病毒載量或病毒數量需要通過滅活和去除的方式消除或清除，以防止傷害患者;這兩個過程通常都不足以單獨使用。根據病毒的具體特性和生物治療產品的類型，有多種病毒滅活和去除方法可供選擇。許多生物治療處理工作流程將使用補充方法的組合來增加可以充分消除的病毒光譜。

失活
多種病毒滅活方法是可能的。最常見的是：

• 基於低 pH 值的方法 – 特別是單株抗體 （mAb） 等生物治療產品
• 基於溶劑或 表面活性劑的方法——通常用於多醣

不太常用的病毒滅活方法包括巴氏殺菌、乾熱和蒸氣熱——特別是對於基於血液或血清的產品。

病毒清除
有據可查的病毒去除方法包括沉澱、色譜和納濾。

病毒滅活和去除方法的選擇取決於所製備的生物治療產品的大小、類型和不穩定性、製造商希望使用的純化方法以及相關病毒的性質和滴度。原料藥 （DS） 的結構和功能與病毒安全性同樣重要的品質屬性，必須始終進行評估和維護。任何病毒滅活方法，無論是低 pH 值還是表面活性劑，都受益於對多個關鍵製程參數 （CPP） 的精確和同時控制;有效了解過程本身和對原料藥 （DS） 的影響所需的能力。 化學合成反應器 能夠在定義的參數空間內映射現代工藝和一致的操作，同時還可以對方法轉移和放大進行建模。

已知生物治療產品的低 pH 病毒滅活受 pH 值、時間、溫度、蛋白質含量以及溶質或緩衝液含量的影響。許多病毒在 pH 值 5.0-5.5 時不可逆轉地變性並有效消滅。根據滅活和清除的病毒範圍，此範圍可能就足夠了。然而，一些包膜病毒僅在 pH 值範圍 3.5-4 時才能有效滅活。

許多單克隆抗體生物治療產品需要對多種病毒類型進行特別廣譜的清除，因此通常採用 3.5-4 的「低」pH 目標（圖 A）。然而，長時間暴露於該 pH 值範圍也會損壞或失活某些生物治療產品，特別是蛋白質或酶，例如血液蛋白、胰島素等（圖 B）。隨著長期暴露於 pH 值壓力下，蛋白質和酶會發生顯著的脫酰胺、變性和聚集。免疫球蛋白溶液（包括 IgG 和 IgM 單克隆抗體）在 pH 3.5-5.5 時通常比其他蛋白質或酶更不敏感，儘管它們仍然不同程度地敏感。在病毒滅活條件下經過足夠的時間後，傳染性病毒負荷應有效降至最低，但是，殘留的病毒顆粒、碎片或其他內容物尚未被物理去除（圖 C）。

對於免疫球蛋白單克隆抗體產品，低pH值是最常用的病毒滅活方法，因為它相對簡單，佔地面積小，並且通常幾乎不需要干預或額外的步驟來去除，這與表面活性劑或其他溶劑不同。然而，適當和最佳條件因分子而異，所需的病毒清除光譜也有所不同。因此，必須對每個分子進行研究，以表徵和驗證可以發生有效病毒滅活的設計空間或操作邊界。這些邊界和病毒滅活過程的結果通常由影響病毒滅活結果並因此影響原料藥 （DS） 品質的所有或至少是選擇的變數或關鍵過程參數 （CPP） 定義。識別和駕馭這些因素將對產品的品質和數量產生積極影響。

傳統上，低 pH 值病毒滅活研究是在具有磁力攪拌的燒杯等容器中使用固定體積和濃度的免疫球蛋白溶液進行的。由於大多數研究材料將使用起始 pH 值接近生理條件的免疫球蛋白溶液，因此病毒滅活研究將尋求闡明試劑添加參數。通常，手動滴定是通過使用滴定管或移液來執行的，同時間歇性記錄 pH 測量值。在完成規定的時間和其他參數保持在足以滅活目標病毒含量的低 pH 條件下後，原料藥 （DS） 或免疫球蛋白溶液將從低 pH 值範圍逆向滴定到適當的生理或輕微鹼性範圍內。這代表通過低 pH 值保持完成病毒滅活。儘管如此，在病毒滅活的低pH滴定研究中，離線分析仍需要樣品萃取，以記錄各種品質屬性，例如透過尺寸交換層析（SEC）等方法進行聚集或脫醯胺。儘管熟練的科學家可以實現精確性，但病毒滅活過程通常很費力，並且受到任何手動過程的自然變化、不准確性和可重複性挑戰的影響。

雖然下游生物製程中低pH值病毒滅活研究的主要需求是定義試劑添加範圍和製程所需的時間，但製程動力學的表徵和複合製程參數的影響也很重要，最終是確保設計病毒滅活製程既穩健又優化的要求。然而，溫度監測和控制經常被忽視，因此在病毒滅活的製程開發研究中是一個不受控制的參數。

這種疏忽可能部分是由於使用了試點甚至商業製造規模的系統，這些系統在貨艙或轉運船中執行病毒滅活，這些船隻可能會記錄但不能控制溫度。規模的代表性，特別是混合的代表性通常是低 pH 病毒滅活研究中容易被忽視的另一個參數，例如通過磁攪拌板控制的手動平台進行的研究。缺乏混合等簡單事物的數據捕獲使得無法驗證研究的假設條件是否正確和一致。

病毒滅活裝置操作的低 pH 值處理在單株抗體的 下游加工 過程中存在過程中產物聚集的潛在風險。本演講由葛蘭素史克的 Hiren D. Ardeshna 主持，討論了一種全因子實驗設計，以研究四個製程參數的影響：

• 低 pH 終點
• 低 pH 值保持時間
• 低 pH 滴定持續時間
• 中和滴定持續時間

溶劑或洗滌劑病毒滅活方法通常用於對抗包膜病毒。所使用的試劑通常對治療性蛋白質或抗體的不穩定性影響可以忽略不計，這些蛋白質或抗體會受到某些低 pH 值方法可能出現的變性或脫酰胺挑戰。用於滅活病毒的溶劑或洗滌劑處理方法與低 pH 值方法具有許多相同的需求和驅動因素;主要用於定義試劑添加的範圍（在本例中為溶劑或洗滌劑）和該過程所需的時間。與低 pH 值病毒滅活一樣，免疫球蛋白或其他原料藥 （DS） 類型的情況也有所不同。因此，必須對每個分子進行研究，以表徵和驗證可以發生有效溶劑或洗滌劑病毒滅活的設計空間或操作邊界。這些邊界和病毒滅活過程的結果類似地由關鍵工藝參數 （CPP） 定義，包括溫度、蛋白質含量、溶劑或洗滌劑含量、滅活條件的時間，以及溶劑或洗滌劑均質的混合和有效性。識別和駕馭這些因素將對產品的品質和數量產生積極影響。

雖然洗滌劑病毒滅活研究不需要與低 pH 研究相同的試劑滴定方式，但仍需要評估關鍵變量的設計空間。與低 pH 值一樣，使用溶劑或去污劑的病毒滅活研究傳統上完全手動表徵該過程。試劑劑量和控制同樣取決於同時執行多項關鍵任務的高技能人員的準確性和精密度。溶劑或洗滌劑病毒滅活研究同樣會受到自然變異、不准確性和可重複性挑戰的影響。

依賴溶劑或去污劑的病毒滅活方法通常需要進一步考慮，通常與低 pH 值方法無關。任何添加的溶劑或清潔劑都必須從原料藥 （DS） 或免疫球蛋白溶液中去除，並透過適當的分析方法進行驗證。通常，溶劑或去污劑是透過層析法或切向流過濾的緩衝液交換來去除的。去除添加的溶劑或洗滌劑有點類似於從低 pH 失活到適當的生理或略微鹼性範圍內的反向 pH 滴定目的。在規模上，當材料從保溫容器通過管柱或其他適當的膜進行溶劑或緩衝液交換時，緩衝液交換或層析方法可能會以連續或半連續單元操作的形式發生。在製程開發中，溶劑或洗滌劑病毒滅活很可能與後續純化或去除步驟分開發生，並不同於以下步驟。因此，這種做法可能會加劇數據或信息的連續性。

各種疫苗產品都會經歷病毒滅活，包括類毒素、重組蛋白、亞單位、多醣，甚至還有少數病毒樣顆粒疫苗。同樣，選擇合適的病毒滅活方法將考慮生物治療產品的性質，以及需要有效清除的病毒的廣度。

一般來說，需要嚴格考慮替代方法或做法，以防止疫苗類型（例如減毒活病毒）受到外來病毒污染——其中生物治療產品是病毒顆粒。此類產品的特定方法可能包括一種或多種納濾或層析工藝，以有效減少各自原材料來源中的外來病毒載量。滅活或破壞的病毒仍可能經歷適當的低 pH 值或基於溶劑或洗滌劑的病毒滅活過程——因為即使病毒產品變性或以其他方式破壞，這仍可能保持所需的免疫刺激效果。

寡核苷酸產物或分子類型的病毒滅活方法並未被廣泛認為是必要的。這主要是由於試劑的性質、反應條件和處理方法始終不利於病毒。目前，許多正在開發和生產中的此類寡核苷酸產品主要是通過切向流過濾或各種類型的層析分離之一進行各種緩衝液交換來純化、濃縮和配製的。

由於需要數據連續性和電子批次記錄， 化學合成反應器 通過設計和執行實驗以及促進數據捕獲和完整性，在病毒滅活過程中充當力量倍增器。正交 過程分析技術 （PAT） 橋接了多種應用和工作流程，例如病毒滅活與緩衝液交換，並更準確地對大規模操作的過程流程進行建模。

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• 按播放並走開;iC 軟體對反應器內的條件做出動態回應。在病毒滅活協議的範圍內始終如一地執行操作。
• 從多個感測器擷取資料，包括 pH 值、電導率、氧化氧化還原電位 （ORP） 和溶解氧。
• 整合用於重量傳質的泵浦或天平等週邊裝置。

原位 FTIR 和拉曼光譜在整個上游、下游、偶聯和配方單元操作中跟踪關鍵生物工藝組件。

葡萄糖和關鍵代謝物可以在上游應用中進行監測，而在 下游製程 中，蛋白質或疫苗濃度、穩定劑、賦形劑和雜質都可以即時監測和控制，而不會出現與離線分析相關的延遲或成本。

這樣可以快速確定工藝端點，並清楚地了解各種工藝參數對產品質量和工藝效率的影響。