Viral inaktivering i bioprocesser

Viral inaktivering är det första av vanligtvis två dedikerade steg som är utformade för att förbättra säkerheten hos bioterapeutiska produkter. Under inaktiveringen förstörs alla virus som finns i den poolade och halvrenade terapeutiska suspensionen avsiktligt eller görs plötsligt icke-patogena, vanligtvis genom att miljön runt viruset förändras så att virusstrukturen orsakas av irreversibel störning och denaturering av virusstrukturen.

Vanligtvis görs detta genom att förändra miljön runt viruset för att orsaka oåterkallelig störning och denaturering av virusstrukturen – t.ex. genom kemiska, fysikaliska eller till och med energetiska metoder. Virusborttagning är separat och distinkt från viral inaktivering eftersom det är en kompletterande process som ytterligare förbättrar virussäkerheten genom att eliminera eller separera viruset från proteinerna eller produkterna av intresse.

Många bioterapeutiska produkter innehåller eller kan bli kontaminerade med virus under produktion eller bearbetning. Patogeniciteten och virusmängden eller mängden virus i dessa modaliteter måste elimineras eller elimineras genom en inaktiverings- och avlägsnandemetod för att förhindra att patienten skadas. Ingen av processerna i sig är vanligtvis tillräcklig. Det finns flera metoder för inaktivering och avlägsnande av virus beroende på virusets specifika egenskaper och typen av bioterapeutisk produkt. Många bioterapeutiska bearbetningsarbetsflöden kommer att använda en kombination av kompletterande metoder för att öka spektrumet av virus som kan elimineras tillräckligt.

Inaktivering
Flera metoder för viral inaktivering är möjliga. De vanligaste är:

• Metoder baserade på lågt pH – särskilt för bioterapeutiska produkter som monoklonala antikroppar (mAbs)
• Lösningsmedels- eller surfaktantbaserade metoder – vanligtvis för polysackarider

Mindre ofta använda virala inaktiveringsmetoder inkluderar pastörisering, torr värme och ångvärme - särskilt för blod- eller serumbaserade produkter.

Borttagning av virus
Väldokumenterade metoder för virusborttagning inkluderar utfällning, kromatografi och nanofiltrering.

Valet av de metoder som ska användas för inaktivering och avlägsnande av virus beror på storleken, typen och labiliteten hos den bioterapeutiska produkt som bereds, den eller de reningsmetoder som tillverkaren önskar använda samt arten och titern hos de virus som ger anledning till betänklighet. Läkemedelssubstansens struktur och funktion är lika viktiga kvalitetsegenskaper tillsammans med virussäkerhet och måste utvärderas och upprätthållas hela tiden. Alla virala inaktiveringsmetoder, lågt pH eller ytaktivt ämne, drar nytta av exakt och samtidig kontroll av flera kritiska processparametrar (CPP). en förmåga som krävs för att effektivt förstå själva processen och dess effekt på läkemedelssubstans (DS). Kemiska syntesreaktorer möjliggör kartläggning av en modern process och konsekvent drift inom ett definierat parameterutrymme, samtidigt som de modellerar för metodöverföring och uppskalning.

Virusinaktivering med lågt pH hos bioterapeutiska produkter är känt för att påverkas av pH, tid, temperatur, proteininnehåll och innehåll av lösta ämnen eller buffert. Många virus denatureras oåterkalleligt och förstörs effektivt vid pH 5,0–5,5. Beroende på omfattningen av virus som ska inaktiveras och rensas kan det här intervallet vara tillräckligt. Flera höljeförsedda virus inaktiveras dock endast effektivt vid pH-intervallet 3,5–4.

Många bioterapeutiska produkter från mAb kräver särskilt bredspektrumclearance av flera virustyper, vilket innebär att ett "lågt" pH-mål på 3,5–4 ofta tillämpas (figur A). Långvarig exponering för detta pH-intervall kan dock också skada eller inaktivera vissa bioterapeutiska produkter, särskilt proteiner eller enzymer som blodproteiner, insulin och andra (figur B). Vid långvarig exponering för pH-stress utsätts proteiner och enzymer för betydande deamidation, denaturering och aggregering. Immunglobulinlösningar (inklusive både IgG och IgM mAbs) är vanligtvis mindre känsliga än andra proteiner eller enzymer vid pH 3,5–5,5 – även om de fortfarande är känsliga i olika grad. Efter tillräckligt lång tid vid virusinaktiverande förhållanden bör den infektiösa virusbördan minimeras effektivt, men kvarvarande viruspartiklar, skräp eller annat innehåll kommer ännu inte att ha avlägsnats fysiskt (figur C).

För immunglobulin mAb-produkter är lågt pH den mest använda metoden för viral inaktivering eftersom den är relativt enkel, behåller ett litet fotavtryck och vanligtvis kräver små ingrepp eller ytterligare steg för att avlägsna, till skillnad från ytaktiva ämnen eller andra lösningsmedel. Ändå varierar de lämpliga och optimala förhållandena mellan molekyler såväl som det nödvändiga spektrumet av viral clearance. Därför måste studier genomföras för varje molekyl för att karakterisera och validera designutrymmet eller de operativa gränserna inom vilka effektiv viral inaktivering kan äga rum. Dessa gränser och resultatet av en viral inaktiveringsprocess definieras vanligtvis av alla, eller åtminstone ett urval, av de variabler eller kritiska processparametrar (CPP) som påverkar resultatet av viral inaktivering och därmed kvaliteten på läkemedelssubstansen (DS). Att identifiera och navigera dessa faktorer kommer att påverka produktens kvalitet och kvantitet positivt.

Traditionellt utförs virusinaktiveringsstudier med lågt pH med en fast volym och koncentration av immunglobulinlösningen i ett kärl såsom en bägare med magnetisk omrörning. Eftersom det mesta av studiematerialet kommer att använda immunglobulinlösningar med ett start-pH som ligger nära fysiologiska förhållanden, kommer virala inaktiveringsstudier att försöka belysa parametrarna för reagenstillsats. Vanligtvis utförs en manuell titrering med hjälp av en byrett eller pipettering samtidigt som pH-mätningen registreras intermittent. Efter att en föreskriven tid har löpt ut och efter att andra parametrar hållits vid låga pH-förhållanden som är tillräckliga för att inaktivera det riktade virusinnehållet, kommer läkemedelssubstansen (DS) eller immunglobulinlösningen att titreras omvänt från det låga pH-området till inom ett lämpligt fysiologiskt eller något basiskt intervall. Detta fungerar som fullbordandet av den virala inaktiveringen genom lågt pH-värde. Ändå, under hela studien av låg pH-titrering för viral inaktivering, krävs provextraktion för offlineanalys för att dokumentera olika kvalitetsattribut såsom aggregering eller deamidation genom metoder som Size Exchange Chromatography (SEC). Även om precision är möjlig från skickliga forskare, är den virala inaktiveringsprocessen vanligtvis mödosam och lider av de naturliga variationerna, felaktigheterna och utmaningarna med reproducerbarhet av alla manuella processer.

Även om det huvudsakliga behovet av studier av viral inaktivering med lågt pH i nedströms bioprocesser är att definiera omfattningen av reagenstillsats och den tid som krävs för processen, är karakterisering av processkinetik och effekten av sammansatta processparametrar också av betydelse och i slutändan ett krav för att säkerställa utformningen av en viral inaktiveringsprocess som är både robust och optimerad. Ändå är temperaturövervakning och kontroll ofta en förbisedd, och därför en okontrollerad, parameter under processutvecklingsstudier för viral inaktivering.

Detta förbiseende kan delvis bero på användningen av pilotsystem eller till och med kommersiella system i tillverkningsskala som utför virusinaktivering i lastrums- eller överföringsfartyg som kan registrera men inte kontrollera temperaturen. Representativitet av skala, i synnerhet representativitet av blandning, är ofta en annan parameter som lätt förbises i studier av virusinaktivering vid lågt pH, t.ex. de som utförs via manuella plattformar som styrs av magnetiska omrörningsplattor. Brist på datainsamling för något så enkelt som blandning gör det omöjligt att verifiera om de antagna förhållandena i studien var korrekta och konsekventa.

Behandlingen med lågt pH-värde för virusinaktiveringsenheter utgör en potentiell risk för aggregering av produkter i processen under nedströmsbearbetning av en monoklonal antikropp. Presentationen presenteras av Hiren D. Ardeshna från GlaxoSmithKline och diskuterar en helt faktoriell experimentell design för att undersöka effekten av fyra processparametrar:

• Slutpunkt för lågt pH
• Hålltid med lågt pH
• Titreringstid med lågt pH
• Varaktighet för neutralisering Titrering

Metoder för inaktivering av virus med lösningsmedel eller rengöringsmedel används ofta mot höljeförsedda virus. Reagenser som används har i allmänhet försumbar inverkan på labiliteten hos det terapeutiska proteinet eller antikropparna, som är utsatta för de utmaningar i form av denaturering eller deamidation som är möjliga med vissa metoder med lågt pH. Behandlingsmetoder med lösningsmedel eller rengöringsmedel för virusinaktivering har många av samma behov och drivkrafter som metoder med lågt pH; Huvudsakligen för att definiera omfattningen av tillsatsen av reagens (i detta fall ett lösningsmedel eller rengöringsmedel) och den tid som krävs för processen. Precis som vid virusinaktivering med lågt pH varierar förhållandena mellan immunglobuliner och andra typer av läkemedelssubstanser (DS). Därför måste studier genomföras för varje molekyl för att karakterisera och validera designutrymmet eller de operativa gränserna inom vilka effektiv inaktivering av lösningsmedel eller rengöringsmedel kan äga rum. Dessa gränser och resultatet av en viral inaktiveringsprocess definieras på liknande sätt av kritiska processparametrar (CPP) inklusive temperatur, proteininnehåll, innehåll av lösningsmedel eller rengöringsmedel, tid vid inaktiveringsförhållanden, samt blandning och effektivitet av homogenisering av lösningsmedel eller rengöringsmedel. Att identifiera och navigera dessa faktorer kommer att påverka produktens kvalitet och kvantitet positivt.

Även om studier av virusinaktivering av tvättmedel inte kräver samma typ av reagementitrering som studier med lågt pH, måste ett designutrymme av kritiska variabler fortfarande utvärderas. Precis som vid lågt pH karakteriserar virala inaktiveringsstudier som använder lösningsmedel eller rengöringsmedel traditionellt processen helt manuellt. Dosering och kontroller av reagens är på samma sätt beroende av noggrannheten och precisionen hos högkvalificerade personer som samtidigt utför flera kritiska uppgifter. Studier av viral inaktivering av lösningsmedel eller rengöringsmedel är också föremål för naturliga variationer, felaktigheter och utmaningar när det gäller reproducerbarhet.

Virala inaktiveringsmetoder som förlitar sig på lösningsmedel eller rengöringsmedel kräver i allmänhet ytterligare en punkt att ta hänsyn till som vanligtvis inte är relevant för metoder med lågt pH. Eventuella tillsatta lösningsmedel eller rengöringsmedel måste avlägsnas från läkemedelssubstansen (DS) eller immunglobulinlösningen och verifieras med en lämplig analysmetod. Vanligtvis avlägsnas lösningsmedel eller rengöringsmedel via antingen kromatografi eller buffertutbyte via tangentiell flödesfiltrering. Avlägsnandet av tillsatta lösningsmedel eller rengöringsmedel är i viss mån analogt med syftet med omvänd pH-titrering från en låg pH-inaktivering tillbaka till inom ett lämpligt fysiologiskt eller något grundläggande intervall. I stor skala skulle buffertbyte eller kromatografiska metoder sannolikt förekomma som kontinuerliga eller halvkontinuerliga enhetsoperationer när materialet rör sig från ett lastrumskärl genom en kolonn eller annat lämpligt membran för lösningsmedels- eller buffertutbyte. Vid processutveckling är det troligt att inaktiveringen av lösningsmedlet eller tvättmedlet sker separat och distinkt från det efterföljande renings- eller avlägsnandesteget. Som sådan kan data- eller informationskontinuitet förvärras av denna praxis.

Olika vaccinprodukter genomgår viral inaktivering, inklusive toxoid, rekombinant protein, subenhet, polysackarid och till och med några få virusliknande partikelvacciner. Återigen kommer valet av en lämplig viral inaktiveringsmetod att ta hänsyn till den bioterapeutiska produktens karaktär, liksom bredden av virus som behöver elimineras effektivt.

I allmänhet måste man noga överväga alternativa metoder eller metoder som förhindrar ovidkommande viruskontaminering för vaccintyper, t.ex. levande, försvagade virus – där den bioterapeutiska produkten är en viruspartikel. Särskilda metoder för sådana produkter kan omfatta en eller flera nanofiltrerings- eller kromatografiska processer för effektiv minskning av främmande virusmängd i respektive råvarukällor. Inaktiverade eller förstörda virus kan fortfarande genomgå en lämplig viral inaktiveringsprocess med lågt pH-värde eller lösningsmedel eller rengöringsmedel – eftersom detta fortfarande kan bibehålla den önskade immunstimulerande effekten även om virusprodukten denatureras eller på annat sätt störs.

Virala inaktiveringsmetoder för oligonukleotidprodukt - eller molekyltyper anses i stor utsträckning inte vara nödvändiga. Detta beror främst på reagensernas natur, reaktionsförhållanden och bearbetningsmetoder som är konsekvent ogynnsamma för virus. För närvarande är många sådana oligonukleotidprodukter under utveckling och produktion i första hand reade, koncentrerade och formulerade genom olika buffertutbyten via tangentiell flödesfiltrering eller genom en av de olika typerna av kromatografisk separation.

Med behovet av datakontinuitet och elektroniska batchregistreringar fungerar kemiska syntesreaktorer som en kraftmultiplikator i virala inaktiveringsprocesser både genom design och utförande av experiment och genom att underlätta datainsamling och integritet. Ortogonal processanalytisk teknik (PAT) överbryggar flera tillämpningar och arbetsflöden, till exempel viral inaktivering med buffertutbyte, och modellerar processflöden för storskaliga operationer på ett mer exakt sätt.

Visa en live eDemo från ditt arbets- eller hemmakontor enligt ditt schema.

• Tryck på Play och gå iväg; iC-programvaran reagerar dynamiskt på förhållandena i reaktorn. Utför konsekvent operationer inom gränserna för protokollet för viral inaktivering.
• Samla in data från flera sensorer, inklusive pH, konduktivitet, oxidativ redoxpotential (ORP) och upplöst syre.
• Integrera perifera enheter som pumpar eller vågar för gravimetrisk massöverföring.

In-situ FTIR och Raman-spektroskopi spårar kritiska bioprocesskomponenter genom uppströms, nedströms, konjugerings- och formuleringsenhetsoperationer.

Glukos och viktiga metaboliter kan övervakas i uppströmstillämpningar, medan protein- eller vaccinkoncentrationer, stabilisatorer, hjälpämnen och föroreningar i nedströmsprocesser kan övervakas och kontrolleras i realtid utan den fördröjning eller kostnad som är förknippad med offlineanalys.

Detta möjliggör snabb bestämning av processens slutpunkter, samt en tydlig förståelse för hur olika processparametrar påverkar produktkvalitet och processeffektivitet.