Syntes av oligonukleotider

Oligonukleotider, eller oligos, är korta enkel- eller dubbelsträngade segment av nukleinsyror som är kopplade samman för att bilda enkelkedjiga biologiska polymerer. De enskilda nukleotidbaserna kan betraktas som ekvivalenta med de monomerer som utgör klassiska kemiska polymerer. En nukleotid består av tre delar: en kvävehaltig bas, en sockermolekyl med fem kolatomer (dessa två delar är nukleosiden) och en eller flera fosfatgrupper. Alternativt kan nukleotider bestå av icke-naturliga eller icke-kanoniska baser. Vanliga exempel är LNA (låsta nukleinsyror), Morpholino och strukturellt modifierade baser eller ryggrader. 

Den komplexa kopplingen av nukleotider bildar de biologiskt kritiska RNA- och DNA-biomolekylerna. När det gäller RNA, som är en enkelsträngad biopolymer, är sockret ribos. I DNA innehåller den dubbelsträngade molekylen sockret deoxiribos. Det är de korta sekvenserna av deoxiriobonukleinsyror och ribonukleinsyror som är byggstenarna i viktiga oligonukleotider. Specifika kopplingar av dessa nukleotider skapar de målbiomolekyler som används i biologiska, medicinska, rättsmedicinska och kliniska tillämpningar. 

Oligonukleotider kan bildas antingen enzymatiskt genom klyvning av större biomolekyler eller genom riktad kemisk syntes. I det senare fallet är organonukleotidsyntes den kemiska process genom vilken nukleosidfosforamiditer – ett viktigt monomeriskt element i oligonukleotider – syntetiseras. Nukleosidfosforamiditer (även kända som nukleosider eller amiditer) är i sig derivat av naturliga eller syntetiska nukleosider.

Nukleotider är därför sammansatta molekyler som består av en kovalent bunden nukleosid och en fosfatgrupp. Nukleotider är kopplade i en specifik sekvens för att bilda den önskade produkten. Således består oligonukleotider av korta segment av nukleinsyror som är kopplade samman och bildar enkelkedjiga biologiska polymerer ("-mers"). Eftersom de flesta oligonukleotider (oligos) vanligtvis består av upp till 20 länkade nukleotider (även om fler är möjliga), kan de ses som små biofarmaceutiska molekyler. 

I likhet med andra farmaceutiskt relevanta små molekyler kräver oligonukleotidsyntes noggrann kontroll med avseende på temperatur, pH, kvalitet på substrat etc. På grund av de typiska metoderna som används vid oligonukleotidsyntes är det svårare att uppnå avkastnings-, renhets- och kostnadsmål ju längre och mer komplicerad nukleotidsekvensen är. Processanalytiska tekniker (PAT) är användbara för att uppnå dessa mål.

Oligonukleotidprimers och sonder

Den vanligaste användningen av syntetiska oligonukleotider är som relativt korta prober och primers (upp till 30-mer) i en mängd olika applikationer. Detta innebär att man syntetiserar en nukleotidsekvens som är parad eller "omvänt komplementär" till en större mål-DNA- eller RNA-sträng (målsekvens). Som primrar används oligos vanligtvis för att initiera enzymatiska reaktioner för att t.ex. skapa miljoner till miljarder kopior av en kort eller lång målsekvens. Välkända exempel är polymeraskedjereaktionen (PCR) eller Sanger-sekvenseringsmetoden. Tillämpningar för oligoprimrar inkluderar DNA-sekvensering, genuttryck, kloning och molekylär diagnostik.

Som sonder används oligos för att identifiera och binda till en specifik DNA- eller RNA-målsekvens för att bekräfta närvaron av denna sekvens i ett givet material. Tillämpningar som använder oligosonder inkluderar blotting-procedurer som northern blotting (för RNA) eller southern blotting (för DNA), som fluoroforkonjugerade sekvenser i mikroarrayer som upptäcker förändringar i genuttryck eller används vid screening för genetiska sjukdomar eller för att identifiera specifika patogener (molekylär diagnostik).

Oligo Therapeutics/Genterapi

I terapeutiska tillämpningar utnyttjar antisense-oligonukleotider (ASO), i allmänhet 20 till 30 arter, naturlig biologi och underlättar genhämning eller nedtystning av gener (förstörelse) av oönskade eller överaktiva RNA-sekvenser, vilket i sin tur blockerar uttrycket av vissa skadade eller överaktiva proteiner som kan orsaka eller underlätta sjukdom. Forskningen kring oligonukleotidbaserade terapier har intensifierats enormt och flera läkemedel har godkänts under de senaste åren.

Framtida användning av syntetiska nukleotider: Utforska DNA- och RNA-vaccinmodaliteter

Även om det inte är en oligonukleotid enligt strikt definition, representerar DNA- eller RNA-baserade vaccinprodukter, såsom mRNA eller plasmid eller vektorbaserade nukleinsyror, med många hundra eller tusentals baser i längd, frontlinjerna för utvecklingen av syntetiska nukleotidteknologier.

I princip skulle DNA- eller RNA-vacciner undvara alla onödiga eller skadliga delar av en patogen bakterie eller ett patogent virus. I stället skulle ett sådant nukleinsyrabaserat vaccin bara innehålla kod för några få delar av patogenens DNA eller RNA. Dessa DNA- eller RNA-strängar instruerar patientens egen kropp att producera enskilda antigener eller fragment av patogenen och främjar sedan ett immunsvar mot antigenet. Med modern databehandling och in silico-modellering kan dessa oligonukleotidvaccinmodaliteter skapas på några dagar eller veckor med en lämplig målsekvens att designa mot. Som plattformsteknik är nukleinsyrabaserade vacciner beroende av standarduppsättningar av byggstenar eller råmaterial som möjliggör en myriad av kombinationer nästan efter behag. Som sådana är de också relativt billiga och lätta att producera jämfört med traditionella vaccinmetoder. Detta är dock fortfarande ett mognande paradigm för den biofarmaceutiska industrin och nya utmaningar tas ständigt upp, vissa unika för oligo- och långnukleinsyraprodukter och andra delade med andra bioterapeutiska modaliteter.

Oligonukleotidsyntes är den kemiska process genom vilken nukleotider är specifikt kopplade för att bilda den önskade sekvenserade produkten. Kontinuerlig fastfassyntes med hjälp av en packad bäddkolonn används ofta för att producera oligonukleotider. I vissa fall används en satsvis uppslamningsreaktion.

Processen för att producera måloligomersekvensen tar ett antal cykler som består av specifika syntetiska steg. I det första steget avlägsnas en 4,4' dimetoxytritylskyddande grupp på den fasta fasstödda nukleotiden. Därefter aktiveras en fosforamiditmonomer och kopplas snabbt genom den fria hydroxylgruppen på den fasta fasbundna nukleotiden för att skapa en dinukleosid som innehåller en fosfittriesterlänk. I det tredje steget oxideras fosfittriestern. I det sista steget (i den första cykeln) "täcks" alla oreagerade nukleosider via acetylering för att förhindra att oönskade sidoprodukter bildas i nästa cykel.

Längden på en oligonukleotid definieras av antalet nukleotider som utgör sekvensen. När det gäller nomenklaturen definieras en sekvens som är 20 nukleotider lång som en "20-mer". Oligolängden är avgörande för de olika applikationerna. Till exempel används kortare oligos ofta i PCR, medan mycket långa sekvenser (200 baser eller mer) används i krävande applikationer som kloning eller CRISPR-redigering. Syntesen av specialiserade, långlivade oligos är utmanande och för att leverera en ren sekvens krävs både effektiva syntes-, kontroll- och reningsmetoder. I genomsnitt är de flesta oligos mindre än 60 år långa. Eftersom det sätt på vilket oligos syntetiseras kräver upprepade reaktionscykler som tillför ytterligare nukleotider, ju längre sekvens som krävs, desto större är sannolikheten för att oönskade biprodukter bildas – vilket kan inkludera deletions- eller trunkeringssekvenser.

Olika reningsmetoder används beroende på kvalitet, kvantitet och kostnadsmål. Till exempel har saltfria oligos biprodukter från den kemiska syntesen avlägsnats, men sekvensfel kvarstår. Dessa avsaltade oligos är användbara ur ett kostnads- och effektivitetsperspektiv för mer rutinmässiga tillämpningar, såsom PCR. För mer krävande tillämpningar tar omvänd faskromatografi bort oönskade sekvenser från en produkt, men inte lika effektivt som gelelektrofores, som ger en högrenad sekvensprodukt, men vanligtvis i begränsade mängder. Särskilt när det gäller kliniska problem är avkastningsbevarande ett ständigt närvarande problem under hela syntesen och även nedströmsbearbetningen.

Klassisk kemisk syntes i fast fas involverar vanligtvis användning av polymer eller specialiserade glaspärlor som inte påverkas av reaktionsförhållandena. Dessa pärlor kan finnas i kolonner där reaktanter, reagenser och lösningsmedel strömmar igenom. Syftet med pärlorna är att fungera som en plattform på vilken substratmolekyler är kovalent bundna och sedan påverkas genom kemisk reaktion. Skydd och avskydd av vissa funktionella grupper på substratmolekylen är nyckeln till syntesen och för att säkerställa att den önskade produkten erhålls. Syntesprodukten avlägsnas genom att kemiskt bryta bindningen mellan den och den underliggande polymerpärlan.

Fastfassyntes är effektiv för att snabbt ge renad produkt, eftersom föroreningar och oreagerade material tvättas bort i de olika stegen i syntesen. Dessutom är hela syntesen mottaglig för datorstyrning och automatisering. Fastfassyntes är den vanligaste metoden som används för anpassad produktion av peptider och oligonukleotider. I det senare fallet krävs många repetitiva cykler för att sekventiellt tillsätta nukleotider för att bilda målsekvensen.

Syntesen av oligonukleotider i fast fas innebär många utmaningar, bland annat minskad avkastning när kedjans längd ökar. Sterisk hinder antas ofta vara en mekanism för dålig avkastning där en eller flera ytfixerade trådar kan störa varje successiv förlängning av sin granne.

För att ta itu med dessa och andra utmaningar finns det olika metoder för syntes av oligonukleotider i vätskefas.

Många grundläggande steg i vätskefassyntesen är analoga med fastfassyntesen. Den huvudsakliga skillnaden är att syntesen sker i lösning eller vätskefas (dvs. INTE fixerad till någon yta). Eftersom denna process fortfarande fortsätter i cykler finns det flera medföljande metoder för att avlägsna oreagerade reagenser samtidigt som den långsträckta oligonukleotidprodukten behålls.

Tekniken att använda PCR för oligonukleotidsyntes etablerades 1985. År 1986 introducerades den första användningen av enzymet Taq-polymeras  . Ändå har industriell oligonukleotidsyntes kämpat för att anta enzymatisk oligonukleotidsyntes av tre viktiga skäl:

1. Enzymatisk syntes kräver en mall på vilken det sekvensutvidgande DNA-polymerasenzymet kan verka. Som sådan kan de novo-oligonukleotidsyntes med enzym inte fungera utan en mall. 
   
2. Många oligo-primers, sonder eller ASO-mål som skulle kunna användas som mall är i sig själva för korta för att effektivt prima och utlösa polymerassyntes.
   
3. Många artificiella terapeutiska oligos är kemiskt modifierade för att underlätta förlängd halveringstid och förbättrad funktionalitet i humoralcirkulationen, modifieringar som nästan eller helt förbjuder deras interaktion med evolutionärt härledda polymeraser (detta gäller främst längre oligoarter som mRNA).

Forskning och utveckling fortsätter för ett konstruerat polymeras som kan användas för ASO-syntes med hjälp av kemiskt modifierade nukleotidlager

Den komplexa karaktären hos oligonukleotidsyntesen skulle kunna dra nytta av en högre grad av processobservation, förståelse för reaktionsmekanismer och avvikelser samt handlingsbara kontroller. Realtidsanalyser med PAT kan minimera eller eliminera behovet av tidskrävande eller långsamma offlineanalyser.

• ReactIR och ReactRaman kan användas för att följa kinetiken för oligonukleotidsyntesreaktioner och jämförelser mellan körningar.
• Exakt temperatur-, omrörnings- och doseringskontroll med EasyMax automatiserade kemiska syntesreaktorer tillsammans med integration av reaktionstrender och mekanismer underlättar datainsamling och enkel hantering genom iC-programvara 

Realtidsövervakningskapaciteten för in-situ FTIR och Raman-spektroskopi för kemi utförd under flödesförhållanden är väl beprövad och är tillämpbar i viktiga steg av oligonukleotidsyntes.

• Syntes av modifierad fosforamidit och naturliga nukleotidmonomerer för att säkerställa struktur och renhet
• Minska risker som orsakas av mekaniska problem med synthesizersystemet eller felaktiga lösningsmatningar
• Spårkopplingsreaktion av fosforamiditmonomer till den fria hydroxylgruppen på den fasta fasbundna nukleotiden
• Spåra denaturering och glödgning av komplementära oligonukleotider i dubbelsträngssyntes.
• Bestämma kemisk reaktionskinetik i glödgningsprocessen – identifiera och spåra intermediärer eller okända
• Korrelera förändringar i spektra med nyckelpunkter i processen
• Tillämpligt på SPS, satsvis och konvergent peptidsyntes (SPS + Solution Phase)

En välkontrollerad syntesmiljö är avgörande för att säkerställa reaktionsresultatet. Automatiserade reaktorplattformar ger förtroende och konsekvens över alla kritiska processparametrar samtidigt.

• En reproducerbar miljö är grundläggande för god vetenskap
• Förstå hur processparametrar påverkar kritiska kvalitetsattribut genom att kombinera data från sensorer och inline PAT
• Protokoll och automatisering minskar manuella risker eller inkonsekvenser
• Underlätta sökbar och strukturerad data
• Förlita dig på årtionden av citeringar och bevis för att skala upp
• Tillämpligt på SPS, satsvis och konvergent peptidsyntes (SPS + Solution Phase)