Synthèse d'oligonucléotide

Les oligonucléotides peuvent être obtenus de manière enzymatique par clivage de biomolécules plus grandes ou par synthèse chimique ciblée. Dans ce dernier cas, la synthèse d'oligonucléotide désigne le processus chimique par lequel les nucléosides phosphoramidites, élément monomère clé des oligonucléotides, sont synthétisés. Les nucléosidiques phosphoramidites (également abrégés sous la forme nucléosides ou amidites) sont eux-mêmes des dérivés de nucléosides naturels ou synthétiques.

Les nucléotides sont donc des molécules composées d'un nucléoside lié de manière covalente et d'un groupe phosphate. Les nucléotides sont liés selon une séquence spécifique afin de constituer le produit souhaité. Ainsi, les oligonucléotides sont constitués de courts segments d'acides nucléiques, liés entre eux pour constituer des polymères biologiques à chaîne unique (« -mères »). Comme la plupart des oligonucléotides (également abrégés sous la forme oligos) peuvent en règle générale comprendre jusqu'à 20 nucléotides liés (davantage sont néanmoins possibles), ils peuvent être considérés comme de petites molécules biopharmaceutiques. 

Tout comme d'autres petites molécules d'intérêt pharmaceutique, la synthèse d'oligonucléotide nécessite un contrôle minutieux en matière de température, de pH, de qualité des substrats, etc. Du fait des méthodes standard utilisées dans la synthèse d'oligonucléotide, plus la séquence des nucléotides est longue et compliquée, plus il est difficile d'atteindre les objectifs de rendement, de pureté et de coût. Les outils analytiques de procédés (PAT) sont utiles pour atteindre ces objectifs.

Les oligonucléotides (ou oligos) sont de courts segments  d'acides nucléiques à simple ou double brin, liés entre eux pour constituer des polymères biologiques à chaîne unique. Les différentes paires de bases de nucléotides peuvent être considérées comme des équivalents des monomères qui composent les polymères chimiques classiques. Un nucléotide se compose de trois parties : une base contenant de l'azote, une molécule de sucre à 5 carbones (ces deux parties constituent le nucléoside), et un ou plusieurs groupes phosphates. Les nucléotides peuvent également être constitués de bases non naturelles ou non canoniques. Les exemples les plus courants sont les LNA (locked nucleic acids – acides nucléiques verrouillés),  le Morpholino et les bases ou squelettes structurellement modifiés. 

La liaison complexe des nucléotides constitue les biomolécules d'ARN et d'ADN essentielles au niveau biologique. Dans le cas de l'ARN, biopolymère à simple brin, le sucre est le ribose. Dans l'ADN, le sucre de la molécule à double brin est le désoxyribose. Il s'agit de courtes séquences d'acides désoxyriobonucléiques et d'acides ribonucléiques qui constituent les composants d'oligonucléotides importants. Certaines liaisons de ces nucléotides créent les biomolécules cibles destinées à des utilisations biologiques, médicales, médico-légales et cliniques. 

Amorces et sondes oligonucléotidiques

Les oligonucléotides synthétiques sont principalement utilisés pour les sondes et amorces relativement courtes (jusqu'à 30 « -mères ») dans divers domaines. Il est nécessaire de synthétiser une séquence de nucléotides qui est appariée ou « également inversée » afin d'obtenir un brin d'ADN ou d'ARN cible plus grand (séquence cible). Sous forme d'amorces, les oligos sont généralement utilisés pour initier des réactions enzymatiques, notamment dans le but de créer des millions, voire des milliards, de copies d'une séquence cible courte ou longue. Parmi les exemples bien connus, citons la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou la méthode de séquençage Sanger. Les amorces oligo sont notamment utilisées pour le séquençage de l'ADN, l'expression génique, le clonage et les diagnostics moléculaires.

Sous la forme de sondes, les oligos servent à identifier et à se lier en une séquence cible spécifique d'ADN ou d'ARN afin de confirmer la présence de cette séquence dans un matériau donné. Les sondes oligo sont notamment utilisées dans les procédures de blot, comme le Northern blot (pour l'ARN) ou le Southern blot (pour l'ADN) sous forme de séquences conjuguées à des fluorophores. On obtient ainsi des micropuces qui détectent les changements dans l'expression génique ou sont utilisées pour le dépistage de maladies génétiques ou encore pour identifier certains agents pathogènes (diagnostic moléculaire).

Oligothérapie/thérapie génique

Dans les applications thérapeutiques, les oligonucléotides antisens (ASO), généralement à 20 à 30 -mères, s'appuient sur la biologie naturelle et facilitent l'inhibition ou l'extinction (destruction) des gènes des séquences d'ARN indésirables ou hyperactives, ce qui bloque ensuite l'expression de certaines protéines endommagées ou hyperactives, responsables de maladies ou propices à leur développement. Ces dernières années, la recherche en matière de thérapies à base d'oligonucléotides s'est fortement intensifiée et plusieurs médicaments ont été approuvés.

Utilisation future des nucléotides synthétiques : exploration des modalités des vaccins ADN et ARN

Même s'il ne s'agit pas d'oligonucléotides à proprement parler, les vaccins à base d'ADN ou d'ARN, comme les ARNm ou les acides nucléiques à base de plasmide ou de vecteur, qui se composent de plusieurs centaines ou milliers de bases, constituent les produits pionniers de l'évolution des technologies des nucléotides synthétiques.

En théorie, les vaccins ADN ou ARN devraient permettre de se passer de toutes les parties inutiles ou nuisibles d'une bactérie ou d'un virus pathogène. En effet, ce type de vaccin à base d'acide nucléique devrait contenir un code se limitant à quelques parties de l'ADN ou de l'ARN de l'agent pathogène. Ces brins d'ADN ou d'ARN ordonneraient au système immunitaire du patient de produire des antigènes individuels ou fragments de l'agent pathogène. Grâce à l'informatique moderne et à la modélisation in silico, ces modalités de vaccins oligonucléotidiques peuvent être mises au point en quelques jours ou semaines à condition de disposer d'une séquence cible adaptée. En tant que plateforme technologique, les vaccins à base d'acide nucléique reposent sur des ensembles standard de composants ou de matières premières permettant un panel quasiment infini de combinaisons. Ils sont donc aussi relativement bon marché et faciles à produire par rapport aux modalités de vaccination traditionnelles. Pour autant, ce concept peut encore être affiné pour l'industrie biopharmaceutique, et de nouveaux défis sont constamment relevés. Certains sont propres aux oligos et aux acides nucléiques longs, tandis que d'autres relèvent aussi d'autres modalités biothérapeutiques.

La synthèse d'oligonucléotide désigne le processus chimique par lequel les nucléotides sont liés spécifiquement afin de constituer un produit présentant la séquence souhaitée. La synthèse continue en phase solide qui s'appuie sur une colonne à couche tassée est couramment utilisée pour produire des oligonucléotides. Dans certains cas, on utilise une réaction en suspension par lots.

Le procédé de production de la séquence d'oligomères cible nécessite un certain nombre de cycles constitués d'étapes synthétiques spécifiques. Lors de la première étape, un groupe protecteur 4,4'-diméthoxytrityle sur le nucléotide en phase solide est éliminé. Un monomère phosphoroamidite est ensuite activé et rapidement couplé par le groupe hydroxyle libre sur le nucléotide lié en phase solide pour créer un dinucléoside contenant une liaison triester de phosphite. Dans la troisième étape, le triester de phosphite est oxydé. Lors de l'étape finale (du premier cycle), tout nucléoside intact est « bloqué » par acétylation pour éviter la formation de produits secondaires indésirables lors du cycle suivant.

La longueur d'un oligonucléotide est définie par le nombre de nucléotides qui composent sa séquence. En matière de nomenclature, une séquence de 20 nucléotides de long est définie comme un « vingt -mères ». La longueur de l'oligo est déterminante pour les différentes applications. Par exemple, les oligos comportant peu de -mères sont couramment utilisés en PCR, tandis que les séquences très longues (200 bases ou davantage) sont utilisées dans des contextes d'application exigeants tels que le clonage ou l'édition CRISPR. La synthèse d'oligos longs spécialisés constitue un défi et l'obtention d'une séquence pure requiert à la fois de disposer d'un contrôle efficace de la synthèse et de méthodes de purification. En moyenne, la plupart des oligos sont constitués de moins de 60 -mères de long. Comme la manière dont les oligos sont synthétisés nécessite des cycles de réaction répétitifs qui ajoutent des nucléotides supplémentaires, plus la séquence requise est longue, plus la probabilité est élevée de constituer des sous-produits indésirables,   susceptibles d'inclure des séquences de délétion ou de troncation.

Diverses méthodes de purification sont utilisées selon les objectifs de qualité, de quantité et de coût visés. Par exemple, les oligos sans sel sont débarrassés des sous-produits de la synthèse chimique, mais des défaillances de séquence demeurent. Ces oligos dessalés sont utiles au niveau du coût et de l'efficacité pour les contextes d'utilisation plus courants, comme la PCR.  Pour les contextes d'utilisation plus exigeants, la chromatographie en phase inverse élimine les séquences indésirables d'un produit, mais pas aussi efficacement que l'électrophorèse sur gel qui permet d'obtenir un produit de séquence hautement purifié, mais généralement en quantités limitées. En particulier pour les préoccupations cliniques, le maintien du rendement constitue une préoccupation constante tout au long de la synthèse et du traitement en aval.

En règle générale, la synthèse chimique classique en phase solide implique de recourir à des polymères ou billes de verre spécialisées qui ne sont pas affectées par les conditions de la réaction. Ces billes peuvent être contenues dans des colonnes dans lesquelles circulent des réactifs et des solvants. Les billes ont pour mission de servir de plateforme sur laquelle les molécules du substrat sont liées de manière covalente, puis soumises à une réaction chimique. La protection et la déprotection de certains groupes fonctionnels sur la molécule de substrat sont essentielles à la synthèse et nécessaires pour garantir l'obtention du produit souhaité. Le produit de synthèse est éliminé par rupture de la liaison chimique l'unissant à la bille polymère. 

La synthèse en phase solide est efficace pour obtenir rapidement un produit purifié. En effet, les impuretés et matériaux intacts sont éliminés lors des différentes étapes de la synthèse. Par ailleurs, l'ensemble de la synthèse peut faire l'objet d'un contrôle informatique et d'une automatisation.  La synthèse en phase solide constitue la méthode la plus couramment utilisée pour la production adaptée de peptides et d'oligonucléotides. Dans ce dernier cas, de nombreux cycles répétitifs sont nécessaires pour ajouter des nucléotides par séquences et ainsi constituer la séquence cible. 

La synthèse d'oligonucléotide en phase solide présente de nombreuses difficultés, parmi lesquelles la diminution du rendement à mesure que la longueur de la chaîne augmente. L'encombrement stérique est souvent considéré comme un mécanisme à faible rendement :  un ou plusieurs brins fixés en surface peuvent interférer avec chaque élongation successive des brins voisins. 

Pour remédier à ces difficultés, ainsi qu'à d'autres problèmes, il existe plusieurs méthodes de synthèse d'oligonucléotide en phase liquide. 

De nombreuses étapes de base de la synthèse en phase liquide sont similaires à la synthèse en phase solide. Principale différence :  la synthèse s'effectue dans une solution ou en phase liquide (autrement dit, elle n'est fixée à AUCUNE surface). Comme ce processus se déroule toujours par cycles, il existe plusieurs méthodes d'accompagnement pour éliminer les réactifs intacts tout en conservant le produit oligonucléotidique allongé.

La technique d'utilisation de la PCR pour la synthèse d'oligonucléotide a été mise au point en 1985. C'est en 1986 que l'enzyme Taq polymérase a été utilisée pour la première fois. Pour autant, la synthèse d'oligonucléotide à l'échelle industrielle a mis du temps avant d'adopter la synthèse d'oligonucléotide enzymatique pour trois raisons principales :

1. La synthèse enzymatique nécessite un modèle sur lequel l'enzyme ADN polymérase d'extension de séquence peut opérer. Ainsi, la synthèse de novo d'oligonucléotides par enzyme ne peut pas fonctionner sans modèle. 
   
2. De nombreuses amorces oligo, sondes ou cibles ASO qui pourraient servir de modèles sont elles-mêmes trop courtes pour amorcer et déclencher efficacement la synthèse de polymérase.
   
3. De nombreux oligos thérapeutiques artificiels sont modifiés chimiquement pour faciliter la prolongation de la demi-vie et l'amélioration du fonctionnement dans la circulation humorale. Ces modifications empêchent quasiment ou complètement leur interaction avec les polymérases dérivées de l'évolution (cela concerne principalement des espèces d'oligo plus longues, du type ARNm).

La recherche et le développement se poursuivent dans le but de mettre au point un polymère modifié capable de synthétiser l'ASO à partir de nucléotides modifiés chimiquement

La nature complexe de la synthèse d'oligonucléotide pourrait bénéficier d'un degré supérieur d'observation des processus, de la compréhension des mécanismes de réaction et des déviations, et de contrôles actionnables. Les analyses en temps réel réalisées avec les technologies PAT pourraient minimiser ou éliminer la nécessité d'analyses hors ligne longues ou lentes.

• Les technologies ReactIR et ReactRaman peuvent être utilisées pour suivre la cinétique des réactions de synthèse d'oligonucléotide et les comparaisons entre les cycles.
• Le contrôle précis de la température, de l'agitation et du dosage avec les réacteurs de synthèse chimique automatisés EasyMax, ainsi que l'intégration des tendances et mécanismes de réaction facilitent la saisie des données et la gestion grâce au logiciel iC 

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy et Qunying Dai, « Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides », Organic Process Research and Development (2015), 19, 203-214.

Les auteurs tiennent à souligner le fait que bien que les protocoles de synthèse automatisée d'oligonucléotide en phase solide soient bien établis, la chimie qu'ils impliquent reste épineuse et coûteuse. Parmi les principaux risques identifiés au niveau de la fabrication, citons :

• Raccordement d'une solution chimique incorrecte à un port d'entrée désigné du synthétiseur
• Préparation quantitative incorrecte d'une solution
• Erreurs susceptibles de provenir de sources mécaniques ou autres sources inconnues associées au synthétiseur

Le fait de ne pas identifier l'un de ces risques et de ne pas y réagir peut entraîner la perte totale du processus. Ainsi, l'utilisation d'une surveillance spectroscopique en temps réel couplée à une modélisation de différenciation, quantitative et MSPC reposant sur des données sur les infrarouges moyens a été évaluée. La technologie ReactIR s'est avérée assurer une garantie et un contrôle en temps réel du processus de synthèse et permettre une meilleure synthèse automatisée d'oligonucléotide. En particulier, la sensibilité, la profondeur des informations, la portée et l'accessibilité empirique de cette approche ont été considérées comme apportant une solution immédiate à un grand nombre de problèmes de fabrication associés à ces composants, dont la confirmation essentielle en ligne de la séquence et de la pureté.

Les capacités de surveillance en temps réel de la FTIR et de la spectroscopie Raman in situ pour la chimie effectuée dans des conditions de flux ont été avérées et s'appliquent aux étapes clés de la synthèse d'oligonucléotide.

• Synthèse de monomères nucléotidiques pour assurer la structure et la pureté
• Atténuer les risques liés aux problèmes mécaniques des synthétiseurs ou à l'alimentation incorrecte de solutions
• Suivre la réaction de couplage du monomère phosphoroamidite au groupe hydroxyle libre sur le nucléotide lié en phase solide
• Suivre la dénaturation et la recuisson des oligonucléotides complémentaires dans la synthèse à double brin
• Déterminer la cinétique des réactions chimiques dans le processus de recuisson : identifier et suivre les intermédiaires ou inconnues
• Corréler les changements survenant dans le spectre avec les points clés du processus
• Applicable aux SPS, aux lots et à la synthèse convergente de peptides (SPS + phase de solution)

Un environnement de synthèse bien contrôlé est indispensable pour garantir le résultat de la réaction. Les plates-formes de réacteur automatisées assurent simultanément la fiabilité et la cohérence de tous les paramètres essentiels au processus.

• Des analyses ne peuvent être fiables que si elles sont réalisées dans un environnement reproductible
• Comprendre l'impact des paramètres du processus sur les attributs de qualité essentiels en combinant les données des capteurs et de la PAT en ligne
• Le protocole et l'automatisation atténuent les risques ou les incohérences manuels
• Faciliter la recherche et la structuration des données
• S'appuyer sur des décennies de comptes rendus et de preuves pour assurer l'évolutivité
• Applicable aux SPS, aux lots et à la synthèse convergente de peptides (SPS + phase de solution)