Downstream verwerking in de biofarma

Downstream processing (DSP) is de reeks eenheidsbewerkingen na de voltooiing van de celgroei en -expansie en de voltooide productie of synthese van geneesmiddelen of andere componenten. Downstream-verwerking heeft tot doel de eerder gesynthetiseerde geneesmiddelsubstantie (DS) of ander product uit de bulkteeltmatrix te isoleren, te zuiveren en te concentreren. Historisch gezien zijn er investeringen gedaan om de opbrengst en titer stroomopwaarts te verbeteren, waardoor de ontwikkeling van biologische geneesmiddelen economischer wordt. In voorgaande jaren werden downstreamprocessen niet op hetzelfde niveau aangepakt en moeten ze nu verder worden geoptimaliseerd.

Biofarmaceutische downstreamverwerking verwijst naar het terugwinnen en zuiveren van een geneesmiddelsubstantie uit natuurlijke bronnen, zoals dierlijke of bacteriële cellen. Biofarmaceutische DSP wordt toegepast in monoklonale antilichamen (mAb) of eiwitprocessen en de vervaardiging van oligonucleotiden, polysachariden, verschillende vaccins, bioconjugaten, gentherapieën en celtherapieproducten.

Downstream-verwerking kan initiële formuleringsactiviteiten omvatten, wat de overgang van DS naar geneesmiddel (DP) betekent. Belangrijke overwegingen zijn onder meer het beheren en meten van productkwaliteitskenmerken, meerdere procesparameters, bronnen en hoeveelheden onzuiverheden, afvalstromen en biologische gevaren.

DSP-activiteiten worden uitgevoerd op procesontwikkelings-, pilot- en productieschaal op laboratoriumschaal en ondersteund door teams voor procesanalytische technologie (PAT) en Manufacturing Science and Technology (MSAT) die zich richten op procesoptimalisatie, opschaling en probleemoplossing. Vergelijkbare downstreamverwerking op ontdekkingsbiologische schalen of vroege stadia van screening van doelen met hoge doorvoer is niet zo gebruikelijk, hoewel het op dezelfde manier kan worden uitgevoerd, in beginsel.

In deze gids wordt besproken hoe wetenschappers procesanalytische technologie (PAT) gebruiken om dagelijkse workflows te transformeren en downstreamprocessen aanzienlijk te verbeteren. Onderwerpen zijn onder meer:

• Monitoring van de eiwitconcentratie
• Optimalisatie van het bufferuitwisselingsproces
• Samenstelling, distributie en morfologie van vaccinadjuvans
• Automatisering van virale inactivatie
• Ontwikkeling van het bioconjugatieproces

• Voorbehandeling: 
  Lysis van oppervlakteactieve stoffen, absorptie in de organische fase: Productscheiding met lysis streeft meestal een basisdoel na: het effectief verstoren van de sekwestrerende structuren die de geneesmiddelsubstantie of het product bevatten en het creëren van fysieke scheiding tussen puin, onzuiverheden en de geneesmiddelsubstantie. Zure of oppervlakteactieve stof lysis wordt bijna uitsluitend gebruikt met bacterie- of gistculturen. Evenzo komt de absorptie en vangst van een product in de organische fase het meest voor bij bacteriële expressie- en productiesystemen en wordt het af en toe gebruikt voor gistsystemen.
  Flocculatie en precipitatie: Dit zijn methoden voor actieve manipulatie van het deeltjessysteem om het doel van scheiding te bereiken. Flocculatie wordt over het algemeen toegepast als een bereidingsmethode vóór filtratie of centrifugatie. Het toepassen van flocculatie zorgt voor een hoge massaflux over filtratie-eenheden en voor een efficiënte en kosteneffectieve scheiding van celmateriaal van supernatant. Aanvullende methoden voor het verwijderen van vlokmiddel en verificatieprotocollen kunnen nodig zijn. Precipitatie is een actieve deeltjesmanipulatie die wordt geactiveerd door veranderende parameters, zoals oplosmiddel en ionische sterkte om de oplosbaarheid te verminderen.
• Centrifugeren: Centrifugatie wordt algemeen aanvaard als een scheidingsmethode in de bioverwerking en is een veelgebruikte en belangrijke techniek die wordt gebruikt om deeltjesresten zonder onderscheid te scheiden op basis van massa of molecuulgewicht als functie van de snelheid van de kom, vul- en afvoersnelheden. Gewone industriële centrifuges verwijderen aanzienlijke hoeveelheden (tot 99%) van de deeltjesmassa voor deeltjesgroottes zo klein als 5 μm, en soms zo klein als 1 μm voor sterk geoptimaliseerde processen. Ondanks deze efficiëntie kunnen centrifuges nog steeds problematische hoeveelheden microdeeltjes, en vooral nanodeeltjes, doorgeven aan stroomafwaartse bewerkingen die verdere verwerking vereisen. Aangezien bioprocessen gewoonlijk een hoge tot zeer hoge totale biomassa (micro- en nanodeeltjes) en variabele uiteindelijke levensvatbare celdichtheden bereiken, kunnen vaste centrifugatiecapaciteiten ook de procesdoorvoer beperken en worden ze niet algemeen als praktisch beschouwd voor continue bioprocessing.
  
• Dieptefiltratie, holle vezel: Afhankelijk van de aard van het product en het proces, omvatten oogstmethoden doorgaans dieptefiltratie (Fig. 1-1) of holle vezelfilters (Fig. 1-2). Bij dieptefiltratie wordt een deeltjesbevattend mengsel door een membraan of een ander grensvlak gepompt om vuil in vloeibare suspensie van het product te scheiden. Holle vezelfilters worden gebruikt in continue bioverwerkingsprocessen om de tot supernatant tot expressie gebrachte geneesmiddelsubstantie (DS) te verwijderen, terwijl een deel van de biomassa tijdelijk in de holle vezel wordt opgevangen voordat ze worden teruggespoeld met tegenstroommedia. Akoestische veldstroomscheiding is een andere opkomende techniek die momenteel vooral in ontwikkelingsomgevingen wordt aangetroffen. Met verschillende werkingsmodi en configuratie kunnen de resultaten:
  • Moduleer geen scheiding van cellen of deeltjes (Fig. 1-3a)
  • Selecteer cel- of deeltjesscheiding van de voedingsstromen in een nieuwe afvangstroom met omleiding of scheiding van een tweede deeltjespopulatie (Fig. 1-3b)
  • Verplaatsing van een volledig deeltjessysteem naar een nieuwe stroom en/of hertoewijzing van vloeistoffen, eventueel in recirculatie (Fig. 1-3c)
  • Hydrodynamisch interageren, waarbij een gemoduleerd mengsel van zowel deeltjesselectie als vloeistofuitwisseling kan optreden (Fig. 1-3d)

Inline deeltjesgrootteanalysatoren, zoals ParticleTrack™ met FBRM-technologie®, meten de accumulatie en grootteverdeling van celbouillon die in of uit filters gaat en kunnen capaciteitscorrelatie of feedbackcontrole bieden om procesverstoringen tot een minimum te beperken. EasyViewer™ met Image2Chords™ voert beeldanalyse uit en extraheert deeltjesaccumulatie, grootteverdeling en morfologie uit in de tijd opgeloste inline beelden van het proces. EasyViewer kan boven of onder filters worden geplaatst en kan capaciteitscorrelatie of feedbackcontrole bieden, maar is het meest waardevol wanneer het wordt toegepast voor analyse van de hoofdoorzaak, karakterisering en morfologie.

De methode en strategie van het vangen veranderen enigszins, afhankelijk van de aard van het doelmolecuul. Antilichamen worden gevangen door affiniteitsharsen zoals Proteïne A en Proteïne G, evenals enkele andere selectief ontworpen methoden. Niet-antilichaameiwitten en oligonucleotiden worden vaak vastgelegd door ionenuitwisselingschromatografie (IEX). Producten zoals polysachariden en complexe glycaanstructuren worden vaak vastgelegd door hydrofobe interactiechromatografie (HIC) of reversed-phase chromatografie (RPC).

De belangrijkste meetdoelen tijdens chromatografie zijn onder meer het maximaliseren van de bindingscapaciteit van het product aan de kolom, gemeten als de massa van het product dat op de kolom is geladen (kolombelasting), minus de massa van het product dat uit de kolomuitlaat komt (bekend als "doorbraak"). UV is de meest gebruikelijke methode voor productmeting, die veel wordt gebruikt voor eiwit- en DNA-metingen. Er zijn ook alternatieve methoden voor product- en niet-productmetingen mogelijk. Inline FTIR-spectroscopie kan worden gebruikt voor kwantificering en discriminatie van componenten zoals oppervlakteactieve stoffen, gewone suiker- of aminozuurbuffers, lipiden, geconjugeerde producten en zelfs producten met variabele conformatiestructuren, zoals die van fragment-, monomeer- of geaggregeerde vormen van mAbs. FTIR wordt meestal gebruikt naast UV wanneer UV alleen niet in staat is om belangrijke niet-eiwit/niet-nucleïnezuurcomponenten te meten.

• Affiniteitschromatografie (eiwit A/G) is een first-pass chromatografische methode (meestal eiwit A of ProA genoemd) die het product van belang (meestal een mAb) scheidt en concentreert van andere oplosbare materialen door het doeleiwit omkeerbaar aan de kolom te binden of te behouden via specifieke bindingsinteracties (afbeelding a) terwijl de andere componenten door de kolom "elueren" (afbeelding b). Een selectieve elutie volgt een reeks wasstappen en geeft vervolgens het doelmolecuul vrij (afbeelding c). 
  
  

• Ionenuitwisselingschromatografie (IEX) scheidt en concentreert het product van belang (eiwitten, oligonucleotiden en andere) van andere oplosbare materialen door het doelmolecuul reversibel aan de kolom te binden of vast te houden op basis van de sterkte van de elektrostatische interactie met het vastefasemateriaal (Fig. 2d) terwijl de andere componenten door de kolom "eluteren". IEX wordt regelmatig gebruikt als aanvullende of alternatieve zuiveringsmethode en is daarom niet beperkt tot afvangtoepassingen.

De snelheid van bemonstering en detectielimiet (LoD) met in-situ FTIR-spectrometers zoals ReactIR™ zijn voordelig voor primaire opnamechromatografie, waarbij meerdere meetpunten worden geregistreerd binnen snel eluerende pieken of fracties, terwijl meerdere componenten kwantitatief worden gedifferentieerd. Inline FTIR-spectroscopie stelt gebruikers in staat om variabele voedingsinputs te bewaken, evenals de harskwaliteit en levensduurprestaties, componenten te identificeren en te fingerprinten, en vertragingen bij het ontvangen van analytische resultaten te elimineren om in realtime gegevensgestuurde beslissingen te nemen.

Ultrafiltratie (UF) wordt vaak gebruikt in downstream bioprocessing voor het concentreren van een verdunde productstroom. Ultrafiltratie scheidt moleculen in een oplossing op basis van de grootte van de membraanporie of de grenswaarde voor het molecuulgewicht. Diafiltratie (DF) wordt meestal gebruikt om het product uit te wisselen in een gewenste buffer (bijv. van een elutiebuffer in een uiteindelijke formuleringsbuffer).

Ultrafiltratie en diafiltratie (samen bekend als bufferuitwisseling) maken doorgaans gebruik van tangentiële stroomfiltratie (TFF), waarbij de toevoer evenwijdig aan het membraanoppervlak stroomt in plaats van loodrecht op het oppervlak (Fig. 3). Bufferwisseling blijft een zeer handmatige handeling die zelden wordt geoptimaliseerd. De productconcentratie wordt over het algemeen geanalyseerd door middel van een vorm van UV-spectroscopie, hetzij standalone, als een detector voor HPLC, of als een methode met variabele padlengte.

Tijdens het proces van bufferuitwisseling doen zich verschillende uitdagingen voor:

• Nauwkeurige tracking van uitwisselingsvolumes
• Betrouwbare procesvoorspelling van niet-representatieve grijpmonsters
• Vertraagde of geknelde responstijden van offline metingen
• Cumulatief productverlies bij extractieve bemonstering
• Verspreiding van fouten in de monstervoorbereiding voor offline UV- en HPLC-metingen

In-situ infrarood - en Raman-spectroscopie maken het mogelijk om meerdere componenten tegelijkertijd te analyseren, met een grotere precisie en een groter dynamisch bereik, en zonder de vertragingen die gepaard gaan met offline analyse. In-situ FTIR spectroscopie met ReactIR kan veel voordelen bieden tijdens de bufferuitwisseling:

• Kwantificeer meerdere hulpstoffen en soorten geneesmiddelen (DS) tegelijkertijd in realtime
• Buffergebruik beheren
• Membraaneffecten monitoren
• Gebruik directe in-situ concentratie in plaats van diavolumebenaderingen
• Verhoog de concentratienauwkeurigheid van +/-5% tot +/-2%
• Elimineer analytische vertragingen

Geautomatiseerde reactoren zoals EasyMax™ versnellen de procesontwikkeling tot 80% door het vastleggen van experimentele gegevens, nauwkeurige controle van alle kritische procesparameters (CPP's) en integratie van biofysische sensoren, waaronder pH, geleidbaarheid, redox en opgeloste zuurstof (DO).

Er zijn verschillende methoden die in volgorde worden gebruikt om de zuiverheid van de geneesmiddelsubstantie (DS) te verhogen. Beginnend met vroege klarings- en extractiestappen, gevolgd door een geschikte methode van opvang en eerste bulkisolatie, vervolgens gevolgd door tussenliggende en vervolgens laatste fasen van zuivering, waarvan de laatste polijstchromatografie, nano/steriele filtratie, kristallisatie en virale klaring omvat (Fig. 4).

Door vertragingen in verband met offline analyse te elimineren, verbeteren in-situ FTIR-metingen de polijstchromatografiestappen door onmiddellijke feedback te geven om fractiecomponenten, waaronder buffers, geneesmiddelen en onzuiverheden, te kwantificeren en te speciëren tijdens tussenliggende zuiveringsstappen. Dit resulteert in verbeterde breuksneden, aggregatie- of fragmentdiscriminatie en totale concentratie in realtime.

Voor virale klaring wordt elk virus dat aanwezig is in de gepoolde en semi-gezuiverde therapeutische suspensie opzettelijk beschadigd of abrupt misvormd tot een niet-pathogene vorm, meestal door de omgeving rond het virus te veranderen. Het beheersen en verfijnen van deze kritische procesparameters (CPP) wordt mogelijk gemaakt door geautomatiseerde reactorplatforms met geïntegreerde biofysische sensoren. Inline procesanalytische technologie (PAT) is nuttig voor het karakteriseren van onzuiverheden in latere stadia van zuivering, aangezien de concentraties over het algemeen hoger zijn en het gemakkelijker is om producten in een semi-gezuiverde matrix te onderscheiden. 

Biogeconjugeerde moleculen zijn ontworpen om een verhoogde werkzaamheid te hebben, mogelijk gemaakt door de gecombineerde functie van twee of meer verschillende therapeutische soorten moleculen. Biogeconjugeerde chemie vereist gedetailleerde proceskarakterisering en -optimalisatie. Conventionele gereedschappen zoals microcentrifugebuisjes, bekers, kookplaten, magnetische roerstaven en transferpipetten zijn niet langer in staat om te voldoen aan de reproduceerbaarheidseisen rond pH, temperatuur, dosering, mengen en andere parameters.

Bioconjugatiechemie is gebaseerd op een reeks goed gecontroleerde stappen in volgorde, waaronder functionele groepsreductie, activering, API-linkerconjugatie naar het primaire biologische geneesmiddel en een willekeurig aantal was-, oplosmiddel- of bufferuitwisselingsstappen (Fig. 5). Biofarmaceutische wetenschappers passen technologie toe die al op grote schaal wordt gebruikt in R&D met kleine moleculen, zoals EasyMax geautomatiseerde synthesereactoren. EasyMax biedt een samenhangende architectuur zodat relevante procesparameters, waaronder pH, geleidbaarheid, redox, temperatuur, roeren, doseren, enz., nauwkeurig worden gecontroleerd en experimentele gegevens nauwkeurig worden vastgelegd. Automatisering van bioconjugatiechemie zorgt voor gegevensintegratie, correlatie van procesgebeurtenissen, experimentele integriteit en opschalingsparameters voor Design of Experiment (DoE).  

EasyMax maakt een snelle beoordeling en nauwkeurige CPP-regeling van de DoE-ruimte mogelijk, inclusief mengomstandigheden, temperatuurregeling, doseringsstrategieën en doseringen. Elimineer experimentele variabiliteit die gepaard gaat met offline, handmatige methoden en slechte kritische procesparametercontroles. In-situ FTIR- en Raman-spectroscopie kan in realtime gedetailleerde mechanistische informatie opleveren, waardoor offline vertragingen en onnauwkeurigheden in de bemonstering worden geëlimineerd.

Het doel van de formulering is om het productmolecuul over te zetten van een omgeving, oplosmiddel of andere fysische toestand die wordt gebruikt om het product te synthetiseren in een vorm die acceptabel is voor klinische toediening bij mensen (Fig. 6). Het productmolecuul is geformuleerd op basis van hoe het eindproduct zal worden gebruikt via inhalatie, injectie of orale dosering. De stabiliteit op lange termijn van het product en de bijbehorende hulpstoffen wordt beoordeeld om ervoor te zorgen dat de gemeten dosis en kritische kwaliteitskenmerken (CQA's) na verwerking, opslag en verzending binnen de specificaties vallen. Naast steriliteit is het waarborgen van de verwijdering van onzuiverheden en endotoxinen en het voorkomen van afbraak van geneesmiddelen (DP) essentieel voor het behoud van de veiligheid en werkzaamheid tijdens de productie en langdurige opslag van een eiwittherapeutisch middel.

Geformuleerde geneesmiddelen omvatten eiwitten (met name mAb), polysachariden, nanodeeltjessystemen, organische stoffen, oligonucleotiden, gentherapieën en vele soorten vaccins. Bepaalde vaccins zullen worden geformuleerd met een adjuvans, meestal een op aluminium gebaseerd deeltje of een organische emulsie. Met name de formulering van vaccins en de synthese van adjuvans zijn workflows die goed gepositioneerd zijn om te profiteren van geautomatiseerde parallelle reactorwerkstations, digitalisering van de workflow en orthogonale procesanalytische technologie (PAT) integratie. Met real-time PAT wordt veel meer kennis over het proces verkregen, in plaats van alleen het analyseren van de start- en eindpunten.

Parallelle reactorsystemen zoals EasyMax controleren alle kritische procesparameters en integreren inline PAT-tools zoals ReactIR, ReactRaman™, ParticleTrack, EasyViewer en andere biofysische sensoren. Deze technologieën worden vaak gebruikt bij de formulering om de stabiliteit van de substantie van geneesmiddelen en geneesmiddelen, de eindconcentratie, de adjuvante synthese, polymerisaties, inkapseling, adsorpties en andere deeltjesgebeurtenissen te karakteriseren.

Heeft u vragen of heeft u hulp nodig bij uw technische toepassing, dan staat ons team van Technical Application Consultants voor u klaar om u in de juiste richting te begeleiden.