Synthese van oligonucleotiden

Oligonucleotiden, of oligo's, zijn korte enkel- of dubbelstrengs segmenten van nucleïnezuren die aan elkaar zijn gekoppeld om biologische polymeren met één keten te vormen. De afzonderlijke nucleotidebasen kunnen worden gezien als gelijkwaardig aan de monomeren waaruit klassieke chemische polymeren bestaan. Een nucleotide bestaat uit drie delen: een stikstofhoudende base, een suikermolecuul met vijf koolstofatomen (deze twee delen zijn de nucleoside) en een of meer fosfaatgroepen. Als alternatief kunnen nucleotiden bestaan uit niet-natuurlijke of niet-canonieke basen. Bekende voorbeelden zijn LNA (vergrendelde nucleïnezuren), Morpholino en structureel gemodificeerde basen of ruggengraat. 

De complexe koppeling van nucleotiden vormt de biologisch kritische RNA- en DNA-biomoleculen. In het geval van RNA, een enkelstrengs biopolymeer, is de suiker ribose. In DNA bevat het dubbelstrengs molecuul de suiker deoxyribose. Het zijn de korte sequenties van deoxyriobonucleïnezuren en ribonucleïnezuren die de bouwstenen zijn van belangrijke oligonucleotiden. Specifieke bindingen van deze nucleotiden creëren de doelbiomoleculen die worden gebruikt in biologische, medische, forensische en klinische toepassingen. 

Oligonucleotiden kunnen enzymatisch worden gevormd door splitsing van grotere biomoleculen of door gerichte chemische synthese. In het laatste geval is organonucleotidesynthese het chemische proces waarbij nucleosidefosforamidieten - een belangrijk monomeer element van oligonucleotiden - worden gesynthetiseerd. Nucleoside fosforamidieten (ook bekend als nucleosiden of amidieten) zelf zijn derivaten van natuurlijke of synthetische nucleosiden.

Nucleotiden zijn daarom samengestelde moleculen die bestaan uit een covalent gekoppelde nucleoside en een fosfaatgroep. Nucleotiden worden in een specifieke sequentie aan elkaar gekoppeld om het gewenste product te vormen. Oligonucleotiden bestaan dus uit korte segmenten van nucleïnezuren die aan elkaar zijn gekoppeld en biologische polymeren met één keten ("-meren") vormen. Aangezien de meeste oligonucleotiden (oligo's) doorgaans uit maximaal 20 gekoppelde nucleotiden bestaan (hoewel er meer mogelijk zijn), kunnen ze worden gezien als kleine biofarmaceutische moleculen. 

Net als andere farmaceutisch relevante kleine moleculen, vereist de synthese van oligonucleotiden een zorgvuldige controle met betrekking tot temperatuur, pH, kwaliteit van substraten, enz. Vanwege de typische methoden die worden gebruikt bij de synthese van oligonucleotide, hoe langer en gecompliceerder de nucleotidesequentie, hoe moeilijker het is om te voldoen aan de doelstellingen voor opbrengst, zuiverheid en kosten. Process Analytical Technologies (PAT's) zijn nuttig om deze doelen te bereiken.

Oligonucleotide primers en sondes

Het meest voorkomende gebruik van synthetische oligonucleotiden is als relatief korte sondes en primers (tot 30-mer) in een breed scala aan toepassingen. Dit omvat het synthetiseren van een nucleotidesequentie die gepaard is met of 'omgekeerd complementair' is aan een grotere, doel-DNA- of RNA-streng (doelsequentie). Als primers worden oligo's meestal gebruikt om enzymatische reacties op gang te brengen om bijvoorbeeld miljoenen tot miljarden kopieën van een korte of lange doelsequentie te maken. Bekende voorbeelden zijn de polymerasekettingreactie (PCR) of de Sanger-sequencingmethode. Toepassingen voor oligo-primers zijn onder meer DNA-sequencing, genexpressie, klonen en moleculaire diagnostiek.

Als sondes dienen oligo's om een specifieke DNA- of RNA-doelsequentie te identificeren en eraan te binden om de aanwezigheid van deze sequentie in een bepaald materiaal te bevestigen. Toepassingen met oligo-sondes zijn onder meer blottingprocedures zoals northern blotting (voor RNA) of southern blotting (voor DNA), als fluorofoor-geconjugeerde sequenties in microarrays die veranderingen in genexpressie detecteren of worden gebruikt bij screening op genetische ziekten of om specifieke pathogenen te identificeren (moleculaire diagnostiek).

Oligo Therapieën/Gentherapie

In therapeutische toepassingen maken antisense-oligonucleotiden (ASO), over het algemeen soorten van 20 tot 30 meren, gebruik van natuurlijke biologie en vergemakkelijken ze genremming of genuitschakeling (vernietiging) van ongewenste of overactieve RNA-sequenties, dit blokkeert op zijn beurt de expressie van bepaalde beschadigde of overactieve eiwitten die ziekten kunnen veroorzaken of vergemakkelijken. Het onderzoek naar therapieën op basis van oligonucleotide is enorm geïntensiveerd en de afgelopen jaren zijn verschillende geneesmiddelen goedgekeurd.

Toekomstig gebruik van synthetische nucleotiden: onderzoek naar DNA- en RNA-vaccinmodaliteiten

Hoewel het volgens strikte definitie geen oligonucleotide is, vertegenwoordigen op DNA of RNA gebaseerde vaccinproducten, zoals mRNA of plasmide of vectorgebaseerde nucleïnezuren, met een lengte van vele honderden of duizenden basen, de frontlinies van evoluerende synthetische nucleotidetechnologieën.

In concept zouden DNA- of RNA-vaccins afzien van alle onnodige of schadelijke delen van een pathogene bacterie of virus. In plaats daarvan zou zo'n vaccin op basis van nucleïnezuur code bevatten voor slechts een paar delen van het DNA of RNA van de ziekteverwekker. Deze DNA- of RNA-strengen instrueren het eigen lichaam van de patiënt om individuele antigenen of fragmenten van de ziekteverwekker te produceren en vervolgens een immuunrespons op het antigeen te bevorderen. Met moderne computers en in silico-modellering kunnen deze oligonucleotidevaccinmodaliteiten binnen enkele dagen of weken worden gemaakt, mits een geschikte doelsequentie wordt gebruikt om tegen te ontwerpen. Als platformtechnologie vertrouwen vaccins op basis van nucleïnezuur op standaardsets van bouwstenen of grondstoffen, waardoor talloze combinaties bijna naar believen mogelijk zijn. Als zodanig zijn ze ook relatief goedkoop en gemakkelijk te produceren in vergelijking met traditionele vaccinmodaliteiten. Dit is echter nog steeds een volwassen paradigma voor de biofarmaceutische industrie en er worden voortdurend nieuwe uitdagingen aangepakt, sommige uniek voor oligo- en lange nucleïnezuurproducten en sommige gedeeld met andere biotherapeutische modaliteiten.

Oligonucleotidesynthese is het chemische proces waarbij nucleotiden specifiek worden gekoppeld om het gewenste sequentieproduct te vormen. Continue synthese van vaste fases met behulp van een gevulde bedkolom wordt vaak gebruikt voor de productie van oligonucleotiden. In sommige gevallen wordt een batch, slibreactie gebruikt.

Het proces van het produceren van de doeloligomeersequentie duurt een aantal cycli die bestaan uit specifieke synthetische stappen. In de eerste stap wordt een 4,4' dimethoxytrinyl-beschermende groep op het door de vaste fase ondersteunde nucleotide verwijderd. Vervolgens wordt een fosforoamidietmonomeer geactiveerd en snel gekoppeld door de vrije hydroxylgroep op het aan de vaste fase gebonden nucleotide om een dinucleoside te creëren dat een fosfiettriesterlink bevat. In de derde stap wordt het fosfiettriester geoxideerd. In de laatste stap (van de eerste cyclus) worden alle niet-gereageerde ondersteunde nucleosiden "afgedekt" via acetylering om te voorkomen dat ongewenste bijproducten in de volgende cyclus worden gevormd.

De lengte van een oligonucleotide wordt bepaald door het aantal nucleotiden waaruit de sequentie bestaat. Wat de nomenclatuur betreft, wordt een sequentie van 20 nucleotiden lang gedefinieerd als een "20-mer". De oligolengte is cruciaal voor de verschillende toepassingen. Oligo's met korte meren worden bijvoorbeeld vaak gebruikt in PCR, terwijl zeer lange sequenties (200 basen of meer) worden gebruikt in veeleisende toepassingen zoals klonen of CRISPR-bewerking. De synthese van gespecialiseerde, lang-mer oligo's is een uitdaging en het leveren van een zuivere sequentie vereist zowel effectieve synthesecontrole- als zuiveringsmethoden. Gemiddeld zijn de meeste oligo's minder dan 60 meter lang. Aangezien de manier waarop oligo's worden gesynthetiseerd repetitieve reactiecycli vereist die extra nucleotiden toevoegen, hoe langer de vereiste sequentie is, hoe groter de kans op het vormen van ongewenste bijproducten - waaronder deletie- of afkapsequenties.

Er worden verschillende zuiveringsmethoden gebruikt, afhankelijk van kwaliteit, kwantiteit en kostendoelstellingen. Bij zoutvrije oligo's zijn bijvoorbeeld bijproducten van de chemische synthese verwijderd, maar blijven er sequentiefouten bestaan. Deze ontzoute oligo's zijn nuttig vanuit het oogpunt van kosten en werkzaamheid voor meer routinematige toepassingen, zoals PCR. Voor meer veeleisende toepassingen verwijdert omgekeerde fasechromatografie ongewenste sequenties uit een product, maar niet zo effectief als gelelektroforese, die een sterk gezuiverd sequentieproduct levert, maar meestal in beperkte hoeveelheden. Vooral voor klinische problemen is het behoud van de opbrengst ook een altijd aanwezig probleem tijdens de synthese en downstream-verwerking.

Klassieke chemische synthese in vaste fase omvat meestal het gebruik van polymeer of gespecialiseerde glasparels die niet worden beïnvloed door de reactieomstandigheden. Deze kralen kunnen zich bevinden in kolommen waarin reactanten, reagentia en oplosmiddelen doorstromen. Het doel van de kralen is om te fungeren als een platform waarop substraatmoleculen covalent worden gebonden en vervolgens worden bewerkt door een chemische reactie. Bescherming en deprotectie van bepaalde functionele groepen op het substraatmolecuul is de sleutel tot de synthese en om ervoor te zorgen dat het gewenste product wordt verkregen. Het syntheseproduct wordt verwijderd door de binding tussen het product en de onderliggende polymeerkraal chemisch te verbreken.

Vastefasesynthese is effectief in het snel opleveren van gezuiverd product, omdat onzuiverheden en niet-gereageerde materialen in de verschillende stappen van de synthese worden weggespoeld. Bovendien is de hele synthese vatbaar voor computerbesturing en automatisering. Synthese in vaste fase is de meest gebruikelijke methode die wordt gebruikt voor de productie van peptiden en oligonucleotiden op maat. In het laatste geval zijn talrijke repetitieve cycli nodig om achtereenvolgens nucleotiden toe te voegen om de doelsequentie te vormen.

Synthese van oligonucleotides in de vaste fase brengt veel uitdagingen met zich mee, waaronder de afname van de opbrengst naarmate de ketenlengte toeneemt. Sterische hinder wordt vaak verondersteld als een mechanisme van slechte opbrengst waarbij een of meer aan het oppervlak gefixeerde strengen elke opeenvolgende verlenging van zijn buurman kunnen verstoren.

Om deze en andere uitdagingen aan te gaan, zijn er verschillende methoden voor de synthese van oligonucleotides in de vloeibare fase.

Veel basisstappen van vloeistoffasesynthese zijn analoog aan vastefasesynthese. Het belangrijkste verschil is dat synthese plaatsvindt in oplossings- of vloeistoffase (d.w.z. NIET gefixeerd op een oppervlak). Aangezien dit proces nog steeds in cycli verloopt, zijn er verschillende begeleidende methoden voor het verwijderen van niet-gereageerde reagentia met behoud van het langwerpige oligonucleotideproduct.

De techniek van het gebruik van PCR voor oligonucleotidesynthese werd in 1985 vastgesteld. In 1986 werd het eerste gebruik van het enzym Taq-polymerase  geïntroduceerd. Toch heeft de industriële oligonucleotidesynthese om drie belangrijke redenen moeite om enzymatische oligonucleotidesynthese toe te passen:

1. Enzymatische synthese vereist een sjabloon waarop het sequentie-uitbreidende DNA-polymerase-enzym kan werken. Als zodanig kan de novo oligonucleotidesynthese door enzym niet werken zonder een sjabloon. 
   
2. Veel oligoprimers, sondes of ASO-targets die als sjabloon kunnen worden gebruikt, zijn zelf te kort om de polymerasesynthese effectief te primen en op gang te brengen . 
   
3. Veel kunstmatige therapeutische oligo's zijn chemisch gemodificeerd om een verlengde halfwaardetijd en verbeterde functionaliteit in de humorale circulatie te vergemakkelijken , modificaties die hun interactie met evolutionair afgeleide polymerasen bijna of volledig verbieden (dit heeft meestal betrekking op langere oligosoorten zoals mRNA).

Het onderzoek en de ontwikkeling van een gemanipuleerd polymerase dat in staat is tot ASO-synthese gaat door met behulp van chemisch gemodificeerde nucleotidevoorraden

De complexe aard van oligonucleotidesynthese zou baat kunnen hebben bij een hogere mate van procesobservatie, begrip van reactiemechanismen en afwijkingen, en bruikbare controles. Real-time analyses met PAT kunnen de noodzaak van tijdrovende of trage offline analyses minimaliseren of elimineren.

• ReactIR en ReactRaman kunnen worden gebruikt om de kinetiek van oligonucleotidesynthesereacties en vergelijkingen tussen runs te volgen.
• Nauwkeurige temperatuur-, agitatie- en doseringsregeling met EasyMax geautomatiseerde chemische synthesereactoren , samen met de integratie van reactietrends en -mechanismen , vergemakkelijkt het vastleggen van gegevens en het eenvoudig beheren via iC-software 

De real-time monitoringmogelijkheden van in-situ FTIR en Raman-spectroscopie voor chemie uitgevoerd onder stromingsomstandigheden zijn goed bewezen en zijn toepasbaar in belangrijke stappen van oligonucleotidesynthese.

• Synthese van gemodificeerd fosforamidiet en natuurlijke nucleotidemonomeren om structuur en zuiverheid te garanderen
• Beperk de risico's veroorzaakt door mechanische problemen met de synthesizer of onjuiste oplossingstoevoer
• Spoorkoppelingsreactie van fosforoamidietmonomeer naar de vrije hydroxylgroep op het vastefasegebonden nucleotide
• Spoordenaturatie en gloeien van complementaire oligonucleotiden in dubbelstrengs synthese.
• Bepaal de kinetiek van de chemische reactie in het gloeiproces - identificeer en volg tussenproducten of onbekenden
• Correleer veranderingen in spectra met belangrijke punten in het proces
• Toepasbaar op SPS-, batch- en convergente peptidesynthese (SPS + Solution Phase)

Een goed gecontroleerde syntheseomgeving is van vitaal belang om het resultaat van de reactie te garanderen. Geautomatiseerde reactorplatforms zorgen voor vertrouwen en consistentie in alle kritieke procesparameters tegelijkertijd.

• Een reproduceerbare omgeving is van fundamenteel belang voor goede wetenschap
• Inzicht krijgen in de impact van procesparameters op kritieke kwaliteitskenmerken door gegevens van sensoren en inline PAT te combineren
• Protocol en automatisering beperken handmatige risico's of inconsistenties
• Faciliteer doorzoekbare en gestructureerde gegevens
• Vertrouw op tientallen jaren citatie en bewijs voor opschaling
• Toepasbaar op SPS-, batch- en convergente peptidesynthese (SPS + Solution Phase)