Lihat daftar lengkap sumber daya kimia hijau dan berkelanjutan kami termasuk studi kasus dan contoh industri. Laporan resmi ini menunjukkan bagaimana informasi yang diberikan oleh teknologi canggih dari METTLER TOLEDO membantu mendukung kimia hijau dan berkelanjutan dalam penelitian, pengembangan, dan produksi molekul dan produk farmasi, kimia, dan polimer
Apa itu Kimia Klik?
Kimia klik adalah istilah yang menggambarkan keluarga reaksi kimia yang dirancang agar efisien, selektif, dan sederhana. Reaksi kimia ini dirancang untuk bersifat modular, cakupan yang luas, dan menghasilkan produk sampingan minimal. Reaksi kimia klik banyak digunakan di banyak bidang kimia, termasuk penemuan obat, ilmu material, dan biokonjugasi.
Konsep "kimia klik" diperkenalkan pada tahun 2001 oleh pemenang Hadiah Nobel, K. Barry Sharpless. Istilah "kimia klik" dan "reaksi klik" sering digunakan secara bergantian, tetapi ada perbedaan halus di antara keduanya.
Apa itu reaksi klik?
Reaksi klik mengacu pada reaksi kimia yang memenuhi kriteria kimia klik. Reaksi ini melibatkan penyatuan dua molekul melalui ikatan kimia tertentu, seringkali melibatkan azida, alkuna, atau siklooktyne. Reaksi klik biasanya cepat, menghasilkan tinggi, dan terjadi dalam kondisi ringan, menjadikannya ideal untuk berbagai aplikasi.
Dalam reaksi klik, para ilmuwan menggunakan molekul khusus yang dapat dengan mudah disatukan, seperti sabuk pengaman yang tertekuk dengan sempurna. Mereka sangat penting mengingat konsep ini dapat diterapkan terlepas dari skalanya. Dalam beberapa dekade terakhir, reaksi klik telah banyak digunakan dalam aplikasi kimia khusus, farmasi, biomolekuler, biomedis, dan polimer.
Kimia klik telah merevolusi cara ahli kimia mendekati sintesis molekul kompleks dan mengarah pada pengembangan bahan, obat-obatan, dan produk lain baru yang memiliki aplikasi penting di berbagai bidang.
Klik Kriteria Reaksi
Tujuannya adalah untuk mengembangkan satu set "blok" yang kuat, selektif, dan modular yang berkembang yang bekerja dengan andal dalam aplikasi skala kecil dan besar. Kami telah menyebut dasar pendekatan ini "kimia klik", dan telah mendefinisikan serangkaian kriteria ketat yang harus dipenuhi suatu proses agar berguna dalam konteks ini. Reaksi harus modular, cakupan luas, memberikan hasil yang sangat tinggi, hanya menghasilkan produk sampingan yang tidak menyinggung yang dapat dihilangkan dengan metode nonkromatografi, dan stereospesifik (tetapi tidak harus enantioselektif). Karakteristik proses yang diperlukan termasuk (Kolb et al. 2.1):
- Kondisi reaksi sederhana dan lebih disukai, prosesnya tidak boleh terpengaruh oleh keberadaan oksigen dan air
- Bahan awal dan reagen yang mudah diakses
- Reaksi bebas pelarut, atau menggunakan pelarut jinak atau mudah dihilangkan
- Isolasi produk sederhana
Reaksi klik memiliki properti kunci tertentu yang membuatnya efektif. Mereka mengandalkan kekuatan penggerak termodinamika yang kuat, biasanya lebih dari 20 kkal mol-1, yang berarti mereka dapat terjadi dengan cepat dan hanya menghasilkan satu produk yang diinginkan. Kita dapat menganggap reaksi klik sebagai siap untuk pergi ke satu arah, seperti pegas yang dimuat. Penting untuk memahami properti ini untuk menggunakan reaksi klik secara efektif.
Memajukan Kimia Hijau
Jenis Reaksi Klik
Reaksi CuAAC (Sikloadisi Azida-Alkuna Katalisis Tembaga)
Sikloaddition azida-alkuna yang dikatalisis tembaga adalah reaksi klik pertama yang dikembangkan secara independen oleh pemenang Hadiah Nobel, Sharpless dan Meldal. Reaksi ini, yang diciptakan sebagai "permata mahkota kimia klik," menggunakan katalis tembaga untuk membentuk ikatan baru antara gugus fungsional azida dan alkuna. Hasilnya adalah cincin triazol yang bertindak seperti blok Lego atau gesper sabuk pengaman untuk "mengklik" satu molekul ke molekul lainnya.
Reaksi CuAAC dapat dilakukan dalam prosedur satu pot, artinya semua reaktan dapat digabungkan pada awal reaksi, menyederhanakan proses dan membuatnya lebih efisien. Produk reaksi CuAAC adalah polimer dengan berat molekul tinggi yang murni secara struktural.
Karena sifat-sifat katalis tembaga yang luar biasa, seperti stabilitasnya dalam banyak kondisi reaksi, misalnya hidrolisis, oksidasi, dan reduksi, telah ada penelitian yang cukup besar tentang pengembangan berbagai katalis tembaga (dan logam lain, misalnya, rutenium) untuk sintesis azida-alkuna polimer polimer serta pasca fungsionalisasi polimer.
Reaksi Tiol-Ene
Dalam reaksi tiol-ene, tiol bereaksi dengan alkena untuk membentuk ikatan karbon-belerang, dan ikatan rangkap karbon-karbon baru terbentuk dalam prosesnya. Reaksi tiol-ena memiliki beberapa keunggulan dibandingkan reaksi tradisional, termasuk kemampuan untuk:
- Lanjutkan dalam kondisi ringan
- Mentolerir berbagai kelompok fungsional
- Dilakukan dalam prosedur satu pot, menyederhanakan proses dan meningkatkan efisiensi
Reaksi tiol-yne mirip dengan reaksi tiol-ene, tetapi melibatkan reaksi tiol dengan alkuna untuk membentuk ikatan karbon-belerang, dengan ikatan rangkap ganda karbon-karbon baru yang terbentuk dalam prosesnya. Reaksi ini dapat digunakan untuk membangun dendrimer, hidrogel, dan nanopartikel, serta rantai polimer pasca-fungsional. Gugus alkena dan tiol terminal dapat dengan mudah diperkenalkan, dan reaksi dapat dilakukan bebas dari katalis toksik melalui fotokimia.
Reaksi Diels-Alder
Reaksi sikloadimen Diels-Alder adalah kelas reaksi kimia yang melibatkan pembentukan senyawa siklik dari diena terkonjugasi (molekul yang mengandung dua ikatan rangkap bolak-balik) dan dienofil (molekul yang mengandung ikatan rangkap). Diena dan dienofil mengalami reaksi terpadu di mana ikatan baru terbentuk antara diena dan dienofil untuk menghasilkan senyawa siklik baru.
Meskipun reaksi Diels-Alder adalah alat sintetis yang kuat dan bisa sangat selektif, reaksi ini tidak selalu cepat atau menghasilkan tinggi. Dalam beberapa kasus, kondisi reaksi perlu dikontrol dengan hati-hati untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Selain itu, beberapa reaksi Diels-Alder dapat mengakibatkan reaksi samping atau pembentukan produk sampingan yang tidak diinginkan.
Reaksi SPAAC (Sikloadisi Azide-Alkuna yang Dipromosikan oleh Strain)
Sikloadisi azida-alkuna yang dipromosikan oleh strain (SPAAC) adalah jenis reaksi klik yang tidak memerlukan katalis logam. Sebaliknya, reaksi didorong oleh energi regangan yang melekat pada siklooktyne dan turunannya, yang bereaksi dengan azida untuk membentuk produk triazol yang stabil.
Reaksi itu diterbitkan pada tahun 2004 oleh pemenang Hadiah Nobel Carolyn Bertozzi, yang memenangkan Hadiah Nobel Kimia dengan Sharpless dan Meldal. Bertozzi tahu bahwa tembaga beracun bagi makhluk hidup, jadi dia mencari literatur untuk alternatif untuk reaksi klik azida-alkuna sikloadisi (CuAAC) yang dikatalisis tembaga. Dia menemukan bahwa azida dan alkuna dapat bereaksi bersama jika alkuna dipaksa menjadi struktur kimia berbentuk cincin.
Reaksi SPAAC bekerja dengan baik dalam sel, jadi Bertozzi menunjukkan bahwa itu dapat digunakan untuk melacak glikan, karbohidrat khusus yang terletak di permukaan sel. Ini karena SPAAC sangat selektif dan bioortogonal, artinya dapat terjadi dalam sistem biologis tanpa mengganggu proses biologis lainnya.
SPAAC banyak digunakan dalam biologi kimia dan biokonjugasi, memungkinkan pelabelan dan pencitraan biomolekul seperti glikan, serta pengembangan terapi yang ditargetkan. SPAAC adalah alternatif yang berguna untuk reaksi CuAAC dalam beberapa aplikasi karena kondisi reaksinya yang ringan dan kurangnya katalis. Misalnya, reaksi tersebut juga memungkinkan Bertozzi dan para ilmuwan untuk mempelajari proses penyakit.
Kimia Klik Tetrazine
Kimia klik tetrazine adalah jenis reaksi klik yang melibatkan reaksi tetrazin dengan alkena tegang, seperti trans-siklookten, untuk membentuk produk yang stabil. Reaksinya bersifat bioortogonal, artinya dapat terjadi dalam sistem biologis tanpa mengganggu proses biologis lainnya.
Kimia klik tetrazine sangat berguna untuk pencitraan in vivo dan aplikasi pengiriman obat, karena memungkinkan pelabelan selektif dan penargetan molekul biologis. Selain itu, kimia klik tetrazine cepat dan efisien, terjadi dalam hitungan detik pada suhu kamar. Selektivitas yang tinggi dan kinetika reaksi cepat menjadikan kimia klik tetrazine alat yang ampuh untuk penelitian biologi kimia dan pengembangan obat.
Klik Polimerisasi
Polimerisasi klik adalah jenis reaksi klik yang digunakan untuk mensintesis polimer. Pendekatan ini melibatkan kopling monomer yang cepat dan efisien menggunakan reaksi kimia klik, seperti CuAAC atau kimia tiol-ene.
Polimerisasi klik memiliki beberapa keunggulan dibandingkan metode polimerisasi tradisional, termasuk efisiensi tinggi, selektivitas tinggi, dan kondisi reaksi ringan. Selain itu, polimerisasi klik memungkinkan kontrol struktur dan komposisi polimer yang tepat, memungkinkan penciptaan bahan multifungsi yang kompleks.
Polimerisasi klik telah menemukan banyak aplikasi dalam ilmu material, termasuk pengembangan pelapis, perekat, dan komposit canggih. Kemudahan penggunaan dan keserbagunaan menjadikan polimerisasi klik sebagai alat yang berharga untuk sintesis polimer fungsional dengan sifat yang disesuaikan.
Klik untuk Melepaskan
Click-to-release adalah jenis reaksi klik yang memicu pelepasan molekul bioaktif dari molekul pembawa atau perancah. Pendekatan ini melibatkan penggunaan molekul penghubung yang dapat dibelah oleh reaksi klik, seperti CuAAC atau SPAAC, untuk melepaskan molekul kargo.
Click-to-release sangat selektif dan dapat disesuaikan untuk melepaskan molekul kargo dalam kondisi tertentu, seperti sebagai respons terhadap enzim atau tingkat pH tertentu. Pendekatan ini telah digunakan untuk pengiriman obat yang ditargetkan, di mana molekul kargo dilepaskan di lokasi penyakit atau cedera, meminimalkan efek samping dan meningkatkan kemanjuran terapeutik.
Click-to-release juga telah digunakan dalam ilmu material, di mana ia memungkinkan pelepasan molekul fungsional yang terkontrol dari pelapis, perekat, dan bahan lainnya. Selektivitas tinggi dan sifat pelepasan yang dapat dikontrol menjadikan klik-untuk-rilis alat yang ampuh untuk pengiriman obat yang ditargetkan dan aplikasi lainnya.
Keuntungan dari Reaksi Klik
- Efisiensi tinggi
- Selektivitas tinggi
- Reaktivitas bioortogonal
- Kondisi reaksi ringan
Batasan Reaksi Klik
- Persyaratan katalis beracun
- Kebutuhan akan toleransi kelompok fungsional
- Ketidakcocokan dengan beberapa kondisi reaksi
- Ruang lingkup penerapan terbatas
Masa Depan Reaksi Klik
Klik Kimia Terintegrasi dengan Teknologi Baru
Kimia klik memiliki masa depan yang menjanjikan dengan pengembangan berkelanjutan dan penyempurnaan reaksi klik yang ada, serta penemuan reaksi klik baru dengan efisiensi, selektivitas, dan keserbagunaan yang lebih besar. Teknologi analitik proses (PAT) siap untuk memainkan peran kunci di masa depan ini, dengan memungkinkan pemantauan dan kontrol reaksi klik secara real-time selama proses sintesis dan manufaktur. PAT memungkinkan pengukuran parameter proses utama yang cepat dan berkelanjutan, seperti kinetika reaksi, suhu, dan konsentrasi, memberikan umpan balik yang berharga untuk pengoptimalan dan kontrol proses.
Dalam konteks kimia klik, PAT dapat digunakan untuk memantau kemajuan reaksi klik secara real time, memastikan bahwa reaksi berlangsung secara efisien dan menghasilkan produk yang diinginkan. Selain itu, PAT dapat membantu mengidentifikasi sumber potensial variabilitas atau kotoran, memungkinkan intervensi dini dan koreksi masalah apa pun yang mungkin timbul. Karena kimia klik terus memainkan peran yang semakin penting dalam sintesis kimia, ilmu material, dan pengembangan obat, penggunaan PAT kemungkinan akan menjadi lebih luas, membantu memastikan produksi produk berkualitas tinggi yang konsisten dan efisien.
FTIR In-Situ untuk Profil Reaksi Klik
Spektroskopi FTIR in-situ membantu Anda mendapatkan analisis yang akurat dan real-time dari profil reaksi klik Anda. Spektrometer FTIR ReactIR™ menawarkan sensitivitas tinggi, resolusi, dan akuisisi data yang cepat, yang dapat membantu Anda mengidentifikasi mekanisme dan kinetika profil reaksi klik Anda. ReactIR juga dapat digunakan untuk menganalisis jalur reaksi, memantau kemurnian produk, dan mendeteksi kotoran. ReactIR menggunakan teknologi pendinginan solid-state untuk memberikan kinerja terbaik di kelasnya - tanpa memerlukan nitrogen cair, menyediakan metode yang efisien, andal, dan non-destruktif untuk profil reaksi klik, yang sangat penting untuk kontrol kualitas dan pengoptimalan proses.
Contoh Reaksi Klik di Industri
PAT untuk Reaksi Klik Cycloaddition
Zhang, Y., Lai, W., Xie, S. Q., Zhou, H., & Lu, X. (2021b). Sintesis yang mudah, struktur, dan sifat poli (thioether-co-carbonate) yang bersumber CO2 yang mengandung liontin asetil melalui polimerisasi klik thio-ene. Kimia Polimer, 13(2), 201–208. https://doi.org/10.1039/d1py01477c
Polikarbonat alifatik terbukti signifikan dalam aplikasi biomedis dan sintesis APC baru diteliti secara aktif. Dalam karya ini, poli (thioether-co-carbonate) disintesis dengan gugus asetil yang melekat pada kelompok vinil yang difungsikan bis- dan tris-β-oxo-carbonates. Polikarbonat alifatik dengan tio-linkage dalam rantai utama dan liontin asetil di setiap unit berulang disiapkan melalui polimerisasi klik tiol-ene yang diinduksi fotokimia dari bis- dan tris-vinil-β-oxo-karbonat dengan bisthiol primer. Polikarbonat ini mudah didepolimerisasi dalam kondisi ringan menggunakan t-butil peroksida, menghasilkan karbonat siklik dan poliol yang disubstitusi peroksi. Degradasi ini ditunjukkan menggunakan FTIR in-situ.
Pita peregangan C=O dalam polimer diidentifikasi timbul dari karbonat (1746 cm−1) dan dari gugus asetil yang melekat (1723 cm−1). Pita penyerapan C=O ini berkurang dari waktu ke waktu setelah 1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene (TBD) dan tert-butyl hydroperoxide (TBHP) ditambahkan ke sistem reaksi. Kehadiran bagian atas baru pada 1809 cm−1 yang timbul dari pita peregangan C=O dari karbonat siklik dikaitkan dengan pembentukan karbonat bissiklik yang difungsikan peroksi, dan mencerminkan degradasi polimer.
FTIR In-Situ untuk Elastomer Termoplastik
Bretzler, V., Grübel, M., Meister, S., & Rieger, B. (2014b). Kopolimer bolak-balik yang mengandung PDMS diperoleh dengan polimerisasi klik. Kimia dan Fisika Makromolekul,215(14), 1396–1406. https://doi.org/10.1002/macp.201400178
Penelitian ini menyoroti keunggulan elastomer termoplastik (TPE) dibandingkan polimer elastomer ikatan silang secara kimiawi yang membutuhkan katalis mahal dan memerlukan pertimbangan tambahan. TPE menawarkan manfaat dalam pemrosesan termal, menjadikannya pilihan yang berharga untuk aplikasi seperti pencetakan 3D dan cetakan injeksi. Khususnya, penelitian ini menunjukkan bahwa poli(dimethylsiloxane) dapat digunakan sebagai segmen dalam TPE, dan reaksi klik CuAAC dapat membangun polimer linier berdasarkan PDMS.
Penulis memperluas penelitian ini dengan menampilkan penggabungan berbagai fungsi dalam kopolimer bolak-balik yang mengandung PDMS melalui reaksi CuAAC, yang menghasilkan pembentukan TPE dengan sifat yang beragam. Penulis mengeksplorasi hubungan struktur-properti, yang bergantung pada segmen oligosiloxane yang difungsionalisasi azido yang berbeda, serta geometri dari berbagai komonomer dialkyne yang digunakan dalam polimerisasi.
Spektrometer FTIR in-situ ReactIR memberikan wawasan tentang kinetika polimerisasi dengan melacak peluruhan fungsionalitas azida selama reaksi. Selanjutnya, pengukuran FTIR in-situ menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam laju reaksi polimerisasi dengan penambahan satu ekuivalen tridentate triazol ligan tris ((1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl) amine (TBTA) ke reaksi CuAAC. Selain itu, rasio optimal ligan-ke-logam untuk mencapai efek akselerasi ditentukan antara 0,5 hingga 1,0 eq, menghasilkan laju reaksi tertinggi. Studi ini menjelaskan potensi TPE dan memberikan pemahaman yang komprehensif tentang sifat dan kemampuannya.
Kutipan dan Referensi
Klik Kimia dalam Publikasi Jurnal
- Papan, M., Frieß, F. V., Bitsch, CV, Pieschel, J., Reitenbach, J., & Gallei, M. (2023b). Sintesis modular kopolimer blok fungsional dengan kimia "klik" tiol-maleimide untuk pembentukan membran berpori. Makromolekul, 56(4), 1674–1687. https://doi.org/10.1021/acs.macromol.2c02255
- Bertozzi, CR (2022). Edisi virtual khusus yang merayakan Hadiah Nobel Kimia 2022 untuk pengembangan kimia klik dan kimia bioortogonal. Ilmu Pusat ACS. https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01430
- Devaraj, N. K., & Finn, MG (2021). Pendahuluan: Klik Kimia. Ulasan Kimia, 121(12), 6697–6698. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00469
- Huang, D., Qin, A., & Tang, BZ (2018). Ikhtisar Polimerisasi Klik, Bab 1. Di Klik Polimerisasi. Masyarakat Kimia Kerajaan. https://doi.org/10.1039/9781788010108
- Golas, PL & Matyjaszewski, K. (2010). Mengawinkan kimia klik dengan polimerisasi: memperluas ruang lingkup bahan polimer. Chem. Soc. Rev., 39(4), 1338-1354. https://doi.org/10.1039/b901978m
- Qin, A., Lam, JW YY, & Tang, BZ (2010). Klik Polimerisasi: Kemajuan, Tantangan, dan Peluang. Makromolekul, 43(21), 8693–8702. https://doi.org/10.1021/ma101064u
- Sumerlin, BS & Vogt, AP (2010). Rekayasa Makromolekuler melalui Kimia Klik dan Transformasi Efisien Lainnya. Makromolekul, 43(1), 1–13. https://doi.org/10.1021/ma901447e
- Kolb, HC, Finn, MG, & Sharpless, KB (2001). Klik Kimia: Fungsi Kimia yang Beragam dari Beberapa Reaksi Baik. Angewandte Chemie, 40(11), 2004–2021. https://doi.org/10.1002/1521-3773(20010601)40:11
Investigasi FTIR Polimerisasi Klik
- De Silva, E. H., & Novak, BM (2021). Kontraksi dan ekspansi heliks yang diinduksi suhu pada polycarbodiimides bercabang dan sifat penginderaan uap pelarutnya. J. Ilmu Makromolekuler, Bagian A: Kimia Murni dan Terapan, 59(1), 11–19. https://doi.org/10.1080/10601325.2021.1978849
- Hendriks, B., van den Berg, O., & Du Prez, FE (2019). Resin ikatan silang sendiri uretan polythioether. Kemajuan dalam Pelapis Organik, 136. 105215. https://doi.org/10.1016/j.porgcoat.2019.105215
- Krappitz, T., Brauer, DD, & Theato, P. (2016). Sintesis poli (allyl 2-ylidene-acetate) dan modifikasi pasca-polimerisasi berikutnya melalui reaksi tiol-ene. Kimia Polimer, 7(27), 4525-4530. (Dalam Bahasa Inggris) https://doi.org/10.1039/c6py00818f
- Nguyen, LT, Devroede, J., Plasschaert, K., Jonckheere, L., Haucourt, NH, & Du Prez, F. (2013). Menyediakan busa poliuretan dengan fungsionalitas: perbandingan kinetik dari jalur reaksi "klik" dan kopling yang berbeda. Kimia Polimer, 4(5), 1546-1556. https://doi.org/10.1039/c2py20970e
- Derboven, P., D'hooge, DR, Stamenović, M. M., Espeel, P., Marin, G. B., Du Prez, F. E., & Reyniers, MF. (2013). Pemodelan Kinetik Kimia Tiol−Ene Radikal untuk Desain Makromolekul: Pentingnya Reaksi Samping dan Keterbatasan Difusi. Makromolekul, 46(5), 1732−1742. https://doi.org/10.1021/ma302619k
- Tasdelen, MA (2011). Reaksi "klik" Diels-Alder: aplikasi terbaru dalam polimer dan ilmu material. Polym. Kimia, 2(10), 2133-2145. https://doi.org/10.1039/c1py00041a
- Sun, J., Hu, J., Liu, G., Xiao, D., He, G., & Lu, R. (2011). Sintesis Efisien dari Polimer Kuas Silinder Amfifilik yang Terdefinisi dengan Baik dengan Kepadatan Cangkok Tinggi: Pendekatan Kimia ''Klik'' Interfacial. J. Ilmu Polimer Bagian A: Kimia Polimer, 49(5), 1282–1288. https://doi.org/10.1002/pola.24540
- Bonami, L., Van Camp, W., Van Rijckegem, D., & Du Prez, VE (2009). Akses mudah ke sistem katalis klik yang didukung padatan yang efisien berdasarkan poli(etilenimine). Makromol. Komunikasi Cepat, 30(1), 34–38. https://doi.org/10.1002/marc.200800607
- Fournier, D., & Du Prez, F. (2008). Kimia "klik" sebagai alat yang menjanjikan untuk fungsionalisasi rantai samping poliuretan. Makromolekul, 41(13), 4622-4630. https://doi.org/10.1021/ma800189z
- Du Prez, FE, Lammens, M., & Fournier, D. (2008). Fungsionalisasi struktur polimer berbentuk bintang untuk desain nanopartikel reaktif. Pracetak Polimer 49(2) dari Konferensi ACS ke-236, 127–128. https://www.researchgate.net/profile/Filip-Du-Prez/publication/242268627_Functionalization_of_Star-shaped_Polymer_Structures_For_Design_Of_Reactive_Nanoparticles/links/54ccf09a0cf29ca810f731d8/Functionalization-of-star-shaped-polymer-structures-for-design-of-reactive-nanoparticles.pdf
- Billiet, L., Fournier, D., & Du Prez, F. (2008). Menggabungkan kimia "klik" dan polimerisasi pertumbuhan langkah untuk menghasilkan poliester yang sangat fungsional. Jurnal Ilmu Polimer Bagian A, 46(19), 6552-6564. https://doi.org/10.1002/pola.22966