Přísná analýza je životně důležitá pro ověření čistoty, koncentrace a identity léků. Sledování stability léků je také nezbytné pro zajištění účinnosti v průběhu času za různých podmínek prostředí.

Hodnotí bezpečnost a účinnost produktu na základě analýzy fotostability UV filtrů, charakterizace částic a měření barevných indexů. Detekuje také falšování a kvantifikuje barviva a antioxidanty, aby splnil očekávání spotřebitelů.

Charakterizuje ropu, vypočítává asfaltenové frakce, formuluje indexy aromatického obsahu, určuje obsah síry a vypočítává faktory rozpustnosti.

Určuje chemické vlastnosti, posuzuje kvalitu finálního produktu, studuje složení polymerů, kvalifikuje vodu, určuje čistotu a účinnost barvení, analyzuje fotokatalytickou degradaci a zbytky pesticidů.

Určuje koncentraci a čistotu nukleových kyselin a proteinů, monitoruje mikrobiální buněčné kultury, studuje denaturaci a kinetiku proteinů a analyzuje biologické vzorky, jako je krevní plazma a sérum.

Chcete-li číst UV/Vis spektrum, analyzujete graf absorbance (nebo někdy propustnosti) v závislosti na vlnové délce. Mezi klíčové body, na které je třeba se zaměřit, patří:

• Absorpční špičky: Identifikujte vlnové délky, kde je absorbance nejvyšší; Ty odpovídají elektronovým přechodům v molekulách.
• Špičkové vlnové délky (λmax): Vlnová délka(y), při které dochází k maximální absorbanci, charakteristická pro specifické molekulární struktury nebo funkční skupiny.
• Špičková intenzita: Výška absorpčních píků udává, jak silně látka absorbuje při dané vlnové délce, ve vztahu ke koncentraci a molární absorptivitě.
• Základní stav: Zkontrolujte základní absorbanci v oblastech bez absorpce a posoudte problémy s přístrojem nebo vzorkem.
• Tvar spektra: Tvar a počet píků může poskytnout informace o typech elektronických přechodů a prostředí molekul.

Interpretací těchto vlastností můžete identifikovat sloučeniny, určit koncentraci a studovat molekulární vlastnosti.

UV/Vis spektroskopie obvykle pokrývá rozsah vlnových délek od 190 nm do 780 nm. 

Konkrétněji: 

• Ultrafialová (UV) oblast se obecně pohybuje od 190 nm do 390 nm.
• Viditelná oblast (Vis) se obecně pohybuje v rozmezí od 390 nm do 780 nm.

UV/VIS spektrofotometry METTLER TOLEDO Excellence zasahují dále do blízké infračervené oblasti a dosahují vlnové délky 1100 nm.

UV/Vis spektroskopie je důležitá, protože umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu látek měřením jejich absorpce ultrafialového a viditelného světla.

Tato metoda pomáhá určit koncentraci analytů, studovat chemickou kinetiku, posoudit čistotu, provádět objektivní měření barev a analyzovat molekulární struktury. Jeho aplikace pokrývají širokou škálu oborů, včetně chemie, biologie, vědy o životním prostředí a vědy o materiálech, což z něj činí všestranný a nezbytný nástroj pro analýzu.

UV/Vis spektroskopie měří světlo absorbované vzorkem, aby určila jeho koncentraci a identifikovala sloučeniny. Tento proces zahrnuje odstranění světla.

Naproti tomu fluorescenční spektroskopie měří světlo vyzařované vzorkem poté, co absorbuje světlo, obvykle na delší vlnové délce. Tato technika se zaměřuje na opětovnou emisi světla, což poskytuje mnohem vyšší citlivost pro specifické fluorescenční molekuly.

Chcete-li určit koncentraci neznámého roztoku pomocí UV/Vis spektroskopie, postupujte takto:

1. Připravte si kalibrační křivku: Změřte absorbanci řady standardních roztoků se známými koncentracemi při vlnové délce maximální absorbance (λmax) pro analyt.
2. Vyneste absorbanci vs. koncentraci: Vytvořte kalibrační křivku vynesením hodnot absorbance proti známým koncentracím. Podle Beerova zákona je absorbance přímo úměrná koncentraci.
3. Změřte neznámý vzorek: Zaznamenejte absorbanci neznámého roztoku při stejném λmax.
4. Určete koncentraci: Pomocí kalibrační křivky zjistěte koncentraci odpovídající naměřené absorbanci neznámého vzorku.

Tato metoda se opírá o Beer-Lambertův zákon, který říká, že absorbance A = εbc, kde ε je molární absorptivita, b je délka dráhy a c je koncentrace.

Uvažujme funkční skupinu obsahující atomy s jedním nebo více osamocenými páry elektronů, které neabsorbují ultrafialové/viditelné záření. Když je však tato funkční skupina připojena k chromoforu, mění intenzitu a vlnovou délku absorpce. Tento jev se nazývá auxochrom nebo skupina zvýrazňující barvu.

Přítomnost auxochromu způsobuje posun polohy píku nebo signálu na delší vlnovou délku, což se nazývá bathochromní nebo červený posuv. Funkční skupiny přispívající k bathochromním skupinám jsou substituenty jako methyl, hydroxyl, alkoxy, halogen a aminoskupiny.

Auxochrom, který způsobuje posun polohy píku nebo signálu na kratší vlnovou délku, se nazývá hypsochromní nebo modrý posuv. Kombinace chromoforu a auxochromu se ve skutečnosti chová jako nový chromofor s jiným absorpčním maximem (λ_max). Například benzen ukazuje λ_max při 256 nm, zatímco anilin ukazuje λ_max při 280 nm. Skupina_NH2 tedy působí jako auxochrom a způsobuje posun λ_max na větší hodnotu.

Difrakční mřížky jsou obecně lepší než hranoly pro rozdělení různých vlnových délek, protože:

Vyšší spektrální rozlišení: Mřížky mohou poskytovat mnohem vyšší spektrální rozlišení díky své schopnosti produkovat více ostrých difrakčních řádů, což umožňuje jemnější separaci těsně rozmístěných vlnových délek.

Lineární disperze: Úhlová separace mezi vlnovými délkami v mřížce je lineárněji vztažena k vlnové délce, což usnadňuje analýzu a kalibraci spekter ve srovnání s nelineární disperzí hranolů.

Žádná omezení disperze materiálu: Hranoly se spoléhají na disperzi materiálu (změna indexu lomu s vlnovou délkou), což může omezit výkon, zejména v určitých rozsazích vlnových délek. Rošty využívají interferenčních efektů, které nejsou omezeny vlastnostmi materiálu.

Široký rozsah vlnových délek: Mřížky mohou efektivně pracovat v širším rozsahu vlnových délek, včetně ultrafialového a infračerveného záření, zatímco hranoly mají omezení absorpce a disperze.

Celkově difrakční mřížky poskytují přesnější a univerzálnější separaci vlnových délek než hranoly, a proto se běžně používají ve spektrometrech a optických přístrojích.

Molekuly mohou být analyzovány pomocí UV/Vis spektroskopie, pokud mají nějakou funkční skupinu nebo konjugaci, nebo pokud vytvářejí barevný komplex. Protože anorganické sloučeniny neobsahují žádnou funkční skupinu ani konjugaci, běžnou metodou jejich analýzy je reakce s vhodnou sloučeninou. Vzniká tak barevný komplex, jehož absorbance může být fotometricky měřena ve viditelné oblasti a korelována s jeho skutečnou koncentrací. Například železo se běžně analyzuje reakcí s 1,10-fentrolinem za vzniku komplexu červené barvy. Absorbance komplexu se měří při 570 nm pro odhad koncentrace železa.

Následuje hlavní rozdíl mezi jednopaprskovým a dvoupaprskovým spektrofotometrem.

• Jednopaprskový spektrofotometr: Vzorkem prochází jediný paprsek ze zdroje světla
• Spektrofotometr s dvojitým paprskem: Světelný paprsek ze světelného zdroje je rozdělen na dvě části: jedna část prochází vzorkem a druhá část prochází referenční částí

Rozdělení svazku ve dvoupaprskovém spektrofotometru lze dosáhnout dvěma způsoby:

1. staticky, s částečně vysílacími zrcadly nebo podobným zařízením
2. zeslabení paprsků pomocí pohyblivého optického a mechanického zařízení

Teplota ovlivňuje hodnoty absorbance. Různá rozpouštědla podléhají různým interakcím při různých teplotách. Parametry řešení, které se mění v důsledku změn teploty, jsou:

• Rychlost reakce. Rychlost se mění, když je teplota zvýšená. To může způsobit změnu v aktivitě vzorku. Enzymatické/biomolekulární reakce jsou velmi citlivé na teplotu.
  
• Rozpustnost rozpuštěné látky. Rozpustnost je ovlivněna změnami teploty. Špatná rozpustnost může mít za následek nepřesnou absorpci.
  
• Expanze nebo smršťování rozpouštědla. To může vést ke změně koncentrace roztoku a ovlivnit absorbanci, protože absorbance je lineárně závislá na koncentraci.
  
• Šlírův jev: Tento jev se může objevit při změnách teploty, což vede k sérii konvektivních proudů, které mohou změnit skutečnou absorpci.
  

Parametry optického výkonu, jako je fotometrický šum, přesnost/opakovatelnost vlnové délky, fotometrická opakovatelnost a rozptýlené světlo, nejsou ovlivněny teplotou v rozmezí 10 – 40 °C.

Zatímco optické parametry, jako je fotometrické rozlišení (poměr toluen/hexan) a vlnové délky fotometrické přesnosti (K₂Cr₂O₇ v HClO₄), vykazují teplotní závislost v rozmezí od 0,014 do -0,034/jednotku v rozmezí 10 – 40 °C.

Prostor pro vzorky ve spektrofotometrech UV/Vis array je otevřený vzhledem k tomu, že přístroje s polem používají reverzní optiku a současnou detekci všech vlnových délek spektra.

• Reverzní optika: Světlo se po průchodu vzorkem difraktuje. Díky tomu se na signálu v dané oblasti vlnových délek podílí pouze malá část vnějšího okolního světla.
• Simultánní detekce: Pomocí detektoru pole, který poskytuje 2048 signálů intenzity světla současně, je zaznamenáno celé spektrum během jedné sekundy. Protože je měření velmi rychlé, vliv okolního světla je výrazně snížen.