Kalibrace UV/VIS Spektrofotometrů

Spektrofotometry UV/VIS Excellence se testují podle postupů definovaných v lékopisu Spojených států (USP) 43 – NF 38 a v 10. vydání Evropského lékopisu. Při těchto testech se ověřují následující parametry:

• Přesnost vlnové délky
• Fotometrická přesnost
• Fotometrická opakovatelnost
• Fotometrická linearita*
• Rozptýlené světlo
• Rozlišení

Současně jsou testovány také některé parametry, které v USP ani v Evropském lékopisu vyžadovány nejsou:

• Opakovatelnost vlnové délky
• Fotometrický šum
• Plochost základní čáry
• Fotometrický drift

Tyto testy byly sestaveny tak, aby pokryly veškeré výkonnostní parametry hodnocených spektrofotometrů. Naše spektrofotometry UV7 Excellence všechny přísné požadavky splňují. Jejich podrobnější popis naleznete níže.

*Fotometrická linearita již není ve 43. vydání výslovně zmíněna. Fotometrická přesnost musí být testována v zamýšleném provozním rozsahu. METTLER TOLEDO proto stále doporučuje test fotometrické linearity.

Přesnost vlnové délky vyjadřuje, s jakou přesností přístroj dokáže reprodukovat vlnové délky. Měřením přesnosti vlnové délky je možné určit, zda na ose vlnové délky nedochází k posunům.

Referenční materiály určené k měření přesnosti vlnové délky proto musejí vykazovat úzké a dobře rozpoznatelné píky. K tomuto účelu se často využívá oxid holmitý.

V USP a v Evropském lékopisu se kritéria přijatelnosti liší podle použitého referenčního materiálu a jeho rozsahu vlnových délek. Pro tekuté referenční materiály platí následující kritéria:

USP: ±1 nm pod 400 nm; ±2 nm nad 400 nm
Evropský lékopis: ±1 nm pod 400 nm; ±3 nm nad 400 nm

Podle USP a Evropského lékopisu není přesnost a opakovatelnost vlnové délky vyžadována u spektrofotometrů, které jako detektor využívají diodové pole. Spektrofotometry, které jako detektor využívají diodové pole, neobsahují pohyblivý monochromátor, a proto u nich mezi měřeními nedochází k vychylování.

Fotometrická přesnost vyjadřuje schopnost přístroje správně změřit absorbanci a vrátit hodnotu absorbance, která co nejvíce odpovídá skutečné hodnotě.

Fotometrická přesnost se stanovuje změřením pevných nebo kapalných filtrů se známou koncentrací a absorbancí a porovnáním naměřené absorbance s referenčními hodnotami.

U ultrafialového spektra se používá roztok dichromanu draselného o koncentraci 60 mg/l a u viditelného světla se používá neutrální (ND) filtr s 0,5 A. Kritéria přijatelnosti jsou u obou lékopisů stejné a závisí na intenzitě absorbance referenčního materiálu.

Dichroman draselný: ±0,010 A pod 1,0 A; ±1,0 % (0.010*A) nad 1,0 A
ND: ±0,008 A pod 1,0 A; ±0,8 % (0.008*A) nad 1,0 A

Podle USP a Evropského lékopisu není přesnost a opakovatelnost vlnové délky vyžadována u spektrofotometrů, které jako detektor využívají diodové pole. Spektrofotometry, které jako detektor využívají diodové pole, neobsahují pohyblivý monochromátor, a proto u nich mezi měřeními nedochází k vychylování.

Fotometrická opakovatelnost, v USP též fotometrická správnost, stanovuje míru spolehlivosti a opakovatelnosti, s jakou je spektrofotometr schopen měřit hodnoty absorbance u opakovaných měření.

U tohoto parametru se používají stejné referenční materiály, jako u fotometrické přesnosti. Filtry se šestkrát proměří a následně se podle směrodatné odchylky všech měření vyhodnotí opakovatelnost.

Směrodatná odchylka nesmí přesáhnout 0,005 mA pod 1 A a 0,5 % nad 1 A bez ohledu na použitý referenční materiál a rozsah vlnových délek.

Poznámka: Fotometrická opakovatelnost není vyžadována v Evropském lékopisu.

Fotometrická linearita vyjadřuje linearitu naměřených hodnot (např. absorbance) jako funkci rostoucí koncentrace. Tento parametr je důležitý zejména u kvantitativních stanovení.

Fotometrickou linearitu lze určit pomocí stejných postupů a filtrů jako u stanovení fotometrické přesnosti, je však nutné použít tři různé koncentrace/filtry, které pokryjí rozsah od 0 A do 2 A.

V USP a v Evropském lékopisu se kritéria přijatelnost u fotometrické linearity liší:

Evropský lékopis: Korelační koeficient R2 musí být vyšší než 0,999.
USP: Naměřené hodnoty musí u všech koncentrací/filtrů splňovat kritéria fotometrické přesnosti.

Rozptýlené světlo je definováno jako světlo, které dosáhne detektoru, ale není součástí analýzy. Způsobuje odchylku u příslušné vlnové délky, ale nepochází od měřeného vzorku. Rozptýlené světlo takto pozmění absorbanci vzorku a výsledné hodnoty pak obsahují systematickou chybu.

Rozptýlené světlo se stanovuje měřením cut-off filtru (vodný roztok chloridu draselného) metodou specifické vlnové délky (SWM) a metodou poměru u filtračních roztoků (SFRM).

Kritéria přijatelnosti uvedená v USP a v Evropském lékopisu jsou u KCl následující:

SWM: Amax ≥ 2,0 A
SFRM: Amax ≥ 0,7 A

Rozlišení vyjadřuje rozlišovací schopnost UV/VIS spektrofotometru a jeho schopnost rozlišovat v daném spektru přilehlé struktury.

Rozlišení se stanovuje měřením roztoku toluenu v n-hexanu. K posouzení rozlišení se používá absorpční minimum a maximum ostrého a dobře rozlišeného píku.

USP uvádí, že poměr minimální a maximální absorbance u vlnových délek 267 a 269 nm musí být větší než 1,3, aby bylo rozlišení považováno za dostatečné, kdežto u Evropského lékopisu jsou kritéria přijatelnosti uvedena v samostatné monografii.

UV/VIS spektrofotometry s diodovým polem na rozdíl od uspořádání s monochromátorem neobsahují fyzickou mřížku, která mechanicky definuje šířku spektrálního pásma (SBW). U přístroje s polychromátorem lze ekvivalent SBW vypočítat podle rozlišení.
Například spektrofotometr UV7 Excellence má rozlišení ≥ 1,9, což odpovídá SBW ≤ 1,0 nm.

Výše popsané testy lze provádět manuálně nebo automaticky, u manuálních metod však vždy hrozí menší přesnost. Manuální pracovní postupy jsou časově náročné a náchylné k chybám. Automatické ověřování výkonu má následující výhody:

• Rychlejší výsledky s dohledatelnou dokumentací a validací výsledků.
• Je možné eliminovat chyby při provádění pracovního postupu a přepisování údajů a zároveň není nutné testy opakovat.
• Zajištění shody s normami o integritě dat. Jedná se o významný přínos z hlediska správy dat podle požadavků úřadu FDA.
• Rychlá návratnost investice díky zvýšení produktivity a zabezpečení.

Dodržování směrnic a norem je pro výrobce farmaceutických produktů a jejich dodavatele naprosto zásadní. V rámci Správné měřicí praxe (GMP) je nutné validovat výrobní postupy a analytické metody a současně je nutné kvalifikovat zařízení použité při výrobě a řízení jakosti.

Proto společnost METTLER TOLEDO vyvinula pro UV/VIS spektrofotometry Excellence službu EQPac, abychom zákazníkům naplňování těchto požadavků usnadnili. Služba EQPac je řešení navržené přímo pro účely dodržování právních předpisů, které jsou v dnešní době stále náročnější. Nabízí plně zdokumentovanou odbornou instalaci a kvalifikaci přímo na pracovišti, čímž zajistí shodu s příslušnými předpisy a spolehlivý provoz.

Přečtěte si více o naší službě pro kvalifikaci zařízení a naší službě pro kalibraci UV/VIS spektrofotometrů.