Stroga analiza je ključnega pomena za preverjanje čistosti, koncentracije in identitete zdravil. Spremljanje stabilnosti zdravil je prav tako bistvenega pomena za zagotovitev učinkovitosti skozi čas v različnih okoljskih pogojih.

Ocenjuje varnost in učinkovitost izdelkov z analizo fotostabilnosti UV filtrov, karakterizacijo delcev in merjenjem barvnih indeksov. Prav tako zaznava ponarejanje in količinsko določa barvila in antioksidante, da izpolni pričakovanja potrošnikov.

Karakterizira surovo nafto, izračunava asfaltenske frakcije, oblikuje indekse aromatske vsebnosti, določa vsebnost žvepla in izračunava faktorje topnosti.

Določa kemijske lastnosti, ocenjuje kakovost končnega izdelka, preučuje sestavo polimerov, kvalificira vodo, določa čistost in učinkovitost barvanja, analizira fotokatalitično razgradnjo in ostanke pesticidov.

Določa koncentracijo in čistost nukleinskih kislin in beljakovin, spremlja mikrobne celične kulture, preučuje denaturacijo in kinetiko beljakovin ter analizira biološke vzorce, kot sta krvna plazma in serum.

Za branje UV/Vis spektra analizirate graf absorpcije (ali včasih prepustnosti) v primerjavi z valovno dolžino. Ključne točke, na katere se je treba osredotočiti, vključujejo:

• Absorpcijski vrhovi: Določite valovne dolžine, kjer je absorbanca najvišja; Ti ustrezajo elektronskim prehodom v molekulah.
• Najvišje valovne dolžine (λmax): valovne dolžine, pri katerih se pojavi največja absorbanca, značilne za specifične molekularne strukture ali funkcionalne skupine.
• Intenzivnost vrha: Višina absorpcijskih vrhov kaže, kako močno se snov absorbira pri tej valovni dolžini, kar je povezano s koncentracijo in molarno absorpcijo.
• Izhodišče: Preverite izhodiščno absorbanco v območjih brez absorpcije, da ocenite težave z instrumentom ali vzorcem.
• Oblika spektra: Oblika in število vrhov lahko zagotovita informacije o vrstah elektronskih prehodov in okolju molekul.

Z razlago teh lastnosti lahko identificirate spojine, določite koncentracijo in preučite molekularne lastnosti.

UV/Vis spektroskopija običajno pokriva območje valovnih dolžin od 190 nm do 780 nm. 

Natančneje: 

• Ultravijolično (UV) območje se na splošno giblje od 190 nm do 390 nm.
• Vidno (Vis) območje se običajno giblje od 390 nm do 780 nm.

Spektrofotometri UV/VIS Excellence podjetja METTLER TOLEDO segajo še dlje v bližnje infrardeče območje in dosežejo 1100 nm.

UV/Vis spektroskopija je pomembna, ker omogoča kvalitativno in kvantitativno analizo snovi z merjenjem njihove absorpcije ultravijolične in vidne svetlobe.

Ta metoda pomaga določiti koncentracijo analitov, preučevati kemijsko kinetiko, oceniti čistost, izvajati objektivne meritve barve in analizirati molekularne strukture. Njegove aplikacije pokrivajo širok spekter področij, vključno s kemijo, biologijo, znanostjo o okolju in znanostjo o materialih, zaradi česar je vsestransko in bistveno orodje za analizo.

UV/Vis spektroskopija meri svetlobo, ki jo absorbira vzorec, da določi njegovo koncentracijo in identificira spojine. Ta proces vključuje odstranjevanje svetlobe.

Nasprotno pa fluorescenčna spektroskopija meri svetlobo, ki jo oddaja vzorec, potem ko absorbira svetlobo, običajno pri daljši valovni dolžini. Ta tehnika se osredotoča na ponovno emisijo svetlobe, kar zagotavlja veliko večjo občutljivost za specifične fluorescentne molekule.

Če želite določiti koncentracijo neznane raztopine z uporabo UV/Vis spektroskopije, sledite tem korakom:

1. Pripravimo umeritveno krivuljo: izmerimo absorbanco niza standardnih raztopin z znanimi koncentracijami pri valovni dolžini največje absorbance (λmax) za analit.
2. Narišite absorbanco v primerjavi s koncentracijo: Ustvarite umeritveno krivuljo tako, da prikažete vrednosti absorbance glede na znane koncentracije. Po Beerovem zakonu je absorpcija neposredno sorazmerna s koncentracijo.
3. Izmerite neznani vzorec: zabeležite absorbanco neznane raztopine pri istem λmax.
4. Določite koncentracijo: Z umeritveno krivuljo poiščite koncentracijo, ki ustreza izmerjeni absorbanci neznanega vzorca.

Ta metoda se opira na Beer-Lambertov zakon, ki navaja, da je absorpcija A = εbc, kjer je ε molska absorpcija, b dolžina poti in c koncentracija.

Razmislite o funkcionalni skupini, ki vsebuje atome z enim ali več osamljenimi pari elektronov, ki ne absorbirajo ultravijoličnega / vidnega sevanja. Ko pa je ta funkcionalna skupina pritrjena na kromofor, spremeni intenzivnost in valovno dolžino absorpcije. Ta pojav se imenuje auksokrom ali skupina za izboljšanje barve.

Prisotnost auksokroma povzroči premik položaja vrha ali signala na daljšo valovno dolžino, ki se imenuje batokromni ali rdeči premik. Funkcionalne skupine, ki prispevajo k batokromnim skupinam, so substituenti, kot so metil, hidroksil, alkoksi, halogen in amino skupine.

Auksokrom, ki povzroči premik položaja vrha ali signala na krajšo valovno dolžino, se imenuje hipsokromni ali modri premik. Pravzaprav se kombinacija kromoforja in auksokroma obnaša kot nov kromofor, ki ima različne maksimume absorpcije (λ_max). Na primer, benzen kaže λ_max pri 256 nm, medtem ko anilin kaže λ_max pri 280 nm. Zato skupina NH₂ deluje kot auksokrom in povzroči premik λ_max na večjo vrednost.

Difrakcijske rešetke so na splošno boljše od prizme za delitev različnih valovnih dolžin, ker:

Višja spektralna ločljivost: Rešetke lahko zagotovijo veliko višjo spektralno ločljivost zaradi svoje sposobnosti, da proizvedejo več ostrih difrakcijskih vrst, kar omogoča natančnejše ločevanje tesno razporejenih valovnih dolžin.

Linearna disperzija: Kotna ločitev med valovnimi dolžinami v rešetki je bolj linearno povezana z valovno dolžino, kar olajša analizo in umerjanje spektrov v primerjavi z nelinearno disperzijo prizm.

Brez omejitev disperzije materiala: Prizme se zanašajo na disperzijo materiala (sprememba lomnega količnika z valovno dolžino), ki lahko omeji zmogljivost, zlasti v določenih razponih valovnih dolžin. Rešetke uporabljajo interferenčne učinke, ki niso omejeni z lastnostmi materiala.

Širok razpon valovnih dolžin: Rešetke lahko učinkovito delujejo v širšem razponu valovnih dolžin, vključno z ultravijolično in infrardečo, medtem ko imajo prizme omejitve absorpcije in disperzije.

Na splošno difrakcijske rešetke zagotavljajo natančnejše in vsestransko ločevanje valovnih dolžin kot prizme, zato se pogosto uporabljajo v spektrometrih in optičnih instrumentih.

Molekule se lahko analizirajo z uporabo UV/Vis spektroskopije, če imajo kakršno koli funkcionalno skupino ali konjugacijo ali če proizvajajo barvni kompleks. Ker anorganske spojine ne vsebujejo nobene funkcionalne skupine ali konjugacije, je običajna metoda za njihovo analizo reakcija z ustrezno spojino. Tako nastane barvni kompleks, katerega absorpcijo je mogoče fotometrično izmeriti v vidnem območju in povezati z njegovo dejansko koncentracijo. Na primer, železo se običajno analizira z reakcijo z 1, 10-fentrolinom, da se proizvede kompleks rdeče barve. Absorbanca kompleksa se meri pri 570 nm, da se oceni koncentracija železa.

Sledi glavna razlika med enojnim in dvosnopožnim spektrofotometrom.

• Spektrofotometer z enim žarkom: en sam žarek iz svetlobnega vira prehaja skozi vzorec
• Spektrofotometer z dvojnim žarkom: Svetlobni žarek iz svetlobnega vira je razdeljen na dva dela: en del gre skozi vzorec, drugi del pa skozi referenčno

Delitev žarka v spektrofotometru z dvojnim snopom se doseže na dva načina:

1. statično z delno oddajnimi zrcali ali podobno napravo
2. dušenje žarkov z uporabo premikajoče se optične in mehanske naprave

Temperatura vpliva na vrednosti absorpcije. Različna topila so podvržena različnim interakcijam pri različnih temperaturah. Parametri raztopine, ki se spreminjajo zaradi temperaturnih sprememb, so:

• Hitrost reakcije. Hitrost se spremeni, ko je temperatura povišana. To lahko povzroči spremembo aktivnosti vzorca. Encimske/biomolekularne reakcije so zelo občutljive na temperaturo.
  
• Topnost topne raztopine. Topnost vpliva na spremembe temperature. Slaba topnost lahko povzroči nenatančno absorpcijo.
  
• Raztezanje ali krčenje topila. To lahko povzroči spremembo koncentracije raztopine in vpliva na absorbanco, saj je absorbanca linearno povezana s koncentracijo.
  
• Schlierenov učinek. Ta učinek se lahko pojavi pri temperaturnih spremembah, kar vodi do vrste konvektivnih tokov, ki lahko spremenijo pravo absorpcijo.
  

Na parametre optične zmogljivosti, kot so fotometrični šum, natančnost/ponovljivost valovne dolžine, fotometrična ponovljivost in razpršena svetloba, temperatura v območju od 10 do 40 °C ne vpliva.

Medtem ko optični parametri, kot so fotometrična ločljivost (razmerje toluen/heksan) in valovne dolžine fotometrične natančnosti (K₂Cr₂O₇ v HClO₄), kažejo temperaturno odvisnost od 0,014 do -0,034 / enoto znotraj 10 - 40 °C.

Prostor za vzorce v spektrofotometrih z nizom UV/Vis je odprt zaradi dejstva, da instrumenti z nizom uporabljajo obratno optiko in hkratno zaznavanje vseh valovnih dolžin spektra.

• Obratna optika: Svetloba se difraktira, ko gre skozi vzorec. Zaradi tega le majhen del zunanje svetlobe v okolici prispeva k signalu v določenem območju valovne dolžine.
• Hkratno zaznavanje: Z uporabo detektorja matrike, ki hkrati zagotavlja 2048 signalov svetilnosti, se v eni sekundi zabeleži celoten spekter. Ker je merjenje zelo hitro, se učinek svetlobe v okolici znatno zmanjša.