Ферментативный катализ | Биокатализ

Под биокатализом, или ферментативным катализом, понимается применение биологически активных соединений для ускорения химических превращений. Биокатализ ускоряет различные реакции, где основным компонентом выступают соединения на основе углерода. Эти реакции происходят в различных средах: от бесклеточных, протекающих полностью in vitro, до опосредованных ферментацией процессов в культуре живых клеток.

Биокатализ может стать полезной альтернативой обычному химическому катализу по ряду причин. Ферментативные биокаталитические реакции:

• Отличаются высокой хемо-, регио- и энантиоспецифичностью
• Часто характеризуются быстрой кинетикой
• Требуют менее жестких условий по сравнению с обычным химическим катализом
• Снимают вопросы, связанные с отходами, токсичностью и высокой стоимостью металлических катализаторов
• Снижают энергозатраты, связанные с химическими процессами

Направленная разработка биокатализаторов улучшает их стабильность в растворителях при повышенной температуре, обеспечивая широкое применение биокатализа в фармацевтической, химической, биотопливной и пищевой промышленности.

Биокатализ относится к области «зеленого», экологически ответственного и рентабельного производства химических продуктов. В отличие от химического катализа, биокатализаторам изначально присущи определенные преимущества с точки зрения синтеза:

• Значительное разнообразие соединений, как из природных, так и из генетически модифицированных источников, охватывающее широкий спектр химических превращений
• Специфика биокаталитических реакций, которые снижают потребность в определенных классических методах химического синтеза (технологических процессах), таких как использование блокирующих и деблокирующих групп, разделение энантиомерных смесей и очистка от нежелательных побочных продуктов
• Упрощение аппаратного оформления и требований к сырью, так как многие процессы биокатализа можно проводить в одном аппарате, устраняя стадии, необходимые при обычном химическом катализе  

Ферменты-биокатализаторы обладают важными, свойствами, которые часто оказываются полезны и включают:

A) Связывание и распознавание других биопрепаратов или малых молекул, сайт-специфичное или по функциональным группам

B) Облегчение ассоциации или вытеснения других биопрепаратов или малых молекул

C) Структурные или электростатические свойства, облегчающие перенос ионов

D) Способность к преобразованиям с изменением степени упорядоченности и, следовательно, каталитической активности

E) Аллостерические и непрямые модификации, которые индуцируют или подавляют активность ферментов

Исследования улучшенных или модифицированных рекомбинантных биокатализаторов продолжают расширять возможности их применения в агрессивных химических средах, улучшать условия проведения реакции, устойчивость ферментов и возможность их повторного использования. В настоящее время имеются природные и искусственно созданные биокатализаторы для таких важных химических превращений, как образование связей C — C, амидных связей, образование хиральных аминов и функционализация C — H.

Сфера применения ферментов-биокатализаторов чрезвычайно широка и охватывает практически все отрасли, включая пищевую промышленность, фармацевтику, производство текстиля, биотоплива, бумаги, бытовой химии и товаров для дома. В тонком химическом синтезе, химии фармацевтических препаратов и связанных с ними промежуточных продуктов биокатализ (ферментативный или ферментно-опосредованный катализ) быстро стал передовой технологией. Имеются ферменты для различных биотрансформаций, таких как окисление, восстановление, присоединение и отщепление. 

Шесть основных классов ферментов и примеры их использования: 

1. Оксидоредуктазы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Монооксигеназы, катализирующие реакции присоединения одного атома кислорода, позволяют образовывать связи C — O. Разработаны специальные ферменты для окисления спиртов, кетонов, альдегидов и аминов. Что касается восстановления, то кеторедуктазы (KREDS) и дегидрогеназы позволяют синтезировать энантиоспецифичные спирты. Другие ферменты восстанавливают группы, такие как C = N, превращая нитрилы в амины. 

2. Трансферазы применяются для переноса функциональных групп из одной молекулы в другую. Киназа и фосфатазы (добавление и удаление фосфатов) особенно важны для молекулярных сигнальных каскадов, репликации ДНК, транскрипции РНК и других процессов. Существует также множество биологически значимых трансфераз, которые выполняют функции, например, превращения кетонов или альдегидов в амины, в том числе стереоселективно.

3. Гидролазы катализируют гидролиз различных субстратов. Нуклеазы или протеазы проявляют активность в процессах рециклинга нуклеиновых кислот и пептидов. Такие гидролазы, как липаза, протеаза и ацилаза, действуют как катализаторы реакций 1,4-присоединения Михаэля, широко используемых для образования связей C — C и углерод — гетероатом.

4. Лиазы обычно катализируют реакции образования и разрыва двойных связей. В отличие от реакций замещения, катализируемых гидролазами, для биокаталитического присоединения или удаления CO₂ в фармацевтическом синтезе обычно используются карбоксилазы или декарбоксилазы. Их, как и C-N-лиазы, можно использовать для образования аминокислот, включая замещенные аспарагиновые кислоты и аланины.

5. Изомеразы способствуют перегруппировке атомов в молекулах. Например, рацемазы инвертируют стереохимию целевого хирального углерода, а цис-транс-изомеразы катализируют изомеризацию цис-транс-изомеров в алкенах и циклоалканах. Превращение глюкозы во фруктозу с помощью глюкозоизомеразы является примером важного промышленного применения ферментативной биотрансформации.

6. Лигазы способствуют образованию новых химических связей, когда две молекулы соединяются в одну, более крупную. Одно из наиболее важных направлений — использование ДНК-лигазы, в дополнение к эндо- или экзонуклеазам, для получения рекомбинантных молекул ДНК.

Производство ферментных катализаторов. Как правило, природные или рекомбинантные ферменты для биокатализа синтезируются путем ферментации, чаще всего с использованием бактерий, но иногда их также получают из дрожжевых культур. Хотя ферменты можно получать и из более сложных культур клеток млекопитающих, бактерии и дрожжи обычно содержат достаточное количество естественных молекулярных путей для фолдинга и умеренных посттрансляционных модификаций, необходимых для рекомбинантных биокаталитических ферментов. Полученные таким образом ферменты обычно выделяют путем лизиса или другого метода разрушения клеточных структур, пригодного для высвобождения рекомбинантных ферментов, и далее очищают теми же способами, что и другие биологические фармацевтические препараты. Ферментация, сбор материала и последующее выделение целевого продукта представляют собой отдельные задачи, которые решаются с помощью процессно-аналитической технологии (PAT).

Стабилизация и иммобилизация. Иммобилизация ферментов используется для получения более стабильных и активных ферментов, пригодных для повторного использования. Как правило, поперечно сшитые ферментные агрегаты (ПСФА) могут быть образованы на различных твердых субстратах, таких как кремнезем, смолы и полимеры (например, полиэтиленгликоль), и даже на липидных наночастицах (LNP). В некоторых процессах химии непрерывных потоков ПСФА формируются на поверхностях и датчиках, например на таких, которые используются в измерениях поверхностно-усиленными методами для аналитических или каталитических целей. Проблемы синтеза родственных компонентов, адсорбции, конъюгации и других типов ассоциации, а также стабильности продукта и рецептуры решаются способами, применяемыми при производстве вакцин и использовании адъювантов.

Сбор и выделение продукта. По завершении биокаталитического процесса ПСФА отделяются от продукта и остаточных реагентов для повторного использования или хранения. Впоследствии низкомолекулярные продукты могут быть выделены с помощью фильтрации или хроматографии, хотя во многих случаях предпочтение по-прежнему отдается методам кристаллизации. Высокомолекулярные продукты биокатализа выделяются, как правило, с применением обычных технологий.

Для успешной разработки биокаталитического протокола с использованием любого фермента, как связанного в субстратом или твердой поверхностью, так и свободного, важно учитывать его время полужизни и стабильность. Основные факторы:

• Растворители. — Многие естественные ферменты плохо совместимы с органическими растворителями. Совместимость с органическими растворителями улучшается за счет постоянного расширения спектра ферментов, как рекомбинантных, так и полученных методами генной инженерии. Рекомбинантные ферменты теперь способны катализировать реакции в среде органических растворителей, что позволяет использовать, например, модифицированные фосфорамидиты для синтеза олигонуклеотидов.
• pH. — Обычно ферменты лучше всего работают в узких диапазонах pH с отклонением, не превышающим 0,5 pH. Таким образом, регулирование pH часто является критической стадией многих биокаталитических процессов. Регулировать рН вручную может быть сложно или трудоемко. 
• Температура. — Естественные ферменты и их рекомбинантные аналоги эффективно функционируют при определенной температуре в довольно узких диапазонах. Отклонения температуры могут привести к изменению кинетики реакции, выхода продукта или других важных результатов процесса.
• Концентрация растворенного кислорода. — Этот критический параметр, особенно важный для процессов окисления и восстановления, обычно регулируется барботажем или подачей кислорода или инертного газа в свободное пространство аппарата. Для максимально эффективного использования ферментов класса оксидоредуктаз решающее значение имеет оптимизация количества и массопереноса растворенного кислорода (включая характеристики пузырьков) в реакционной смеси.
• Режим перемешивания, динамика жидкости и газа. — Режим перемешивания может сильно влиять на жизненный цикл биокаталитических ферментов, особенно в течение длительного времени, в непрерывном потоке или в условиях перфузионного процесса. Масштабирование биокаталитических реакций может быть неоптимальным, если режим перемешивания недостаточно продуман. Перемешивание также имеет большое значение для правильного распределения газа и эффективного массопереноса.
• Стехиометрия. — Правильное соотношение реагентов и ферментов имеет решающее значение. Его определяют методом моделирования экспериментов (DoE) с использованием автоматизированных химических реакторов и встроенных средств процессно-аналитической технологии.

Разработка и масштабирование биокаталитических реакций зависят от природы используемых биокатализаторов, субстратов, сопутствующих факторов и условий проведения реакции. Как и в случае химического катализа, эту сложную взаимозависимую матрицу переменных легче всего изучать при строгом контроле переменных реакции и данных аналитических измерений в режиме реального времени. Однако большая часть ограничений, связанных с разработкой, масштабированием и плотностью данных, для современных процессов связана с продолжающейся практикой ручного регулирования реакций биокатализа, которая требует времени и ресурсов. Ручное управление подразумевает присутствие персонала у биореактора для почти постоянного обслуживания, регулирования и отбора проб, чтобы выполнить все более строгие нормативные и организационные требования к описанию процесса и передаче технологии.

Биокатализ без ручного управления возможен благодаря применению лабораторных систем автоматизации, которые реагируют на динамические условия реакции, непрерывно измеряемые с помощью встроенных датчиков и средств процессно-аналитической технологии (PAT). Автоматизированные реакторы синтеза упрощают проведение экспериментов, сводят к минимуму участие оператора и риск человеческой ошибки. Если в дополнение к ним использовать модульные средства автоматического отбора проб из реактора для автономного хроматографического анализа, то можно составить общую картину всех критических параметров процесса (CPP) и выявить тенденции. Данные параметрического контроля и анализа процесса автоматически регистрируются в режиме реального времени с последующим структурированием для управления и архивирования. Уменьшение изменчивости параметров в рамках серии экспериментов и повышенная воспроизводимость в реакторах разного объема дополнительно упрощают масштабирование, основанное на фактических данных.

• Автоматические реакторы EasyMax и OptiMax играют важную роль в обеспечении точного контроля, эффективного моделирования и регистрации влияния важнейших технологических параметров биотрансформации, таких как температура, pH, скорость перемешивания и дозирование.
• Системы спектроскопии in situ ReactIR и ReactRaman полезны для отслеживания и описания основных реакций в режиме реального времени. Погружной зондовый ИК-Фурье спектрометр ReactIR отслеживает ключевые аналиты в растворе без учета взвешенных частиц, таких как целые клетки.
• Система ParticleTrack, измеряющая коэффициент отражения сфокусированного луча (FBRM), оценивает дисперсионный состав гетерогенных суспензий. Программное приложение EasyViewer фиксирует и анализирует изображения частиц in situ в режиме реального времени, характеризуя технологическую среду по мутности, форме, размерам, морфологии, количеству частиц и их распределению.
• Модуль EasySampler обеспечивает полностью автоматический отбор проб из реакционной среды, включая гашение реакции в пробе и разбавление.

Автоматизированный лабораторный реактор EasyMax — это полноценная рабочая станция для оптимизации параметров кристаллизации белков в ходе разработки и масштабирования. Полная автоматизация системы обеспечивает точный контроль над ключевыми параметрами.

• Управление критическими параметрами процесса, включая идентификацию исходного материала, скорость дозирования, температуру, перемешивание, свободное пространство над продуктом, барботаж, данные измерения pH и титрования.
• Готовность к интеграции с аналитическими системами in situ, включая приборы ReactIR (ИК-Фурье-спектроскопия), ReactRaman (рамановская спектроскопия), ParticleTrack (измерение коэффициента отражения сфокусированного луча лазера, FBRM), EasyViewer (анализ изображений, полученных in situ) и EasySampler (автоматический отбор проб из реакционной среды).
• Проведение экспериментов без участия оператора; автоматический отбор проб при необходимости автономного анализа.
• Программное обеспечение iC поддерживает автоматическое выполнение экспериментов и контроль периферийного оборудования, а также сбор всех данных и ведение записей.

Погружной зондовый спектрометр ReactIR предназначен для определения характеристик водо- и органорастворимых компонентов исследуемых биокаталитических систем методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье. Анализ с помощью спектрометра ReactIR не затрудняют ни взвешенные твердые вещества, ни пузырьки газов, ни частицы.

Спектрометр ReactRaman предназначен для молекулярного анализа частиц и реакционной среды методом рамановской спектроскопии.

• Контроль нескольких показателей качества продукта in situ в режиме реального времени в аппарате или в технологическом потоке.
• Отсутствие задержек, связанных с отбором проб.
• Количественная оценка вклада технологических операций в выход продукта и эффективность процесса.
• Получение полезных аналитических данных для принятия решений и контроля в режиме реального времени.
• Поддержка выполнения нормативных требований ICH благодаря проведению экспериментов с большим количеством данных и высокому уровню цифровизации.
• Поддержка масштабирования от лаборатории до производства.
• Измерение концентраций от 500 ppm в объемах от нескольких миллилитров до тысяч литров.

Система ParticleTrack с технологией измерения отражения сфокусированного луча лазера (FBRM) — это оптический прибор с зондовым датчиком, который помещается непосредственно в реактор для отслеживания изменения размеров и количества частиц в режиме реального времени. В системе ParticleTrack для анализа распределения частиц по размерам (Particle Size Distribution; PSD) используется метод распределения длин хорд (CLD).

• Состояние частиц и дисперсных структур непрерывно контролируется по мере изменения условий или параметров эксперимента.
• Наблюдение твердофазного синтеза частиц, иммобилизации ферментов, расщепления и морфологии связанных процессов.
• Контроль роста кристаллов в ходе периодической или непрерывной кристаллизации в режиме реального времени без необходимости отбора проб.
• Определение условий, влияющих на нуклеацию, осаждение, полиморфизм и другие свойства дисперсной системы.

EasyViewer — это анализатор размеров частиц, оснащенный зондовым датчиком, который помещается непосредственно в реактор для получения изображений систем частиц. EasyViewer выполняет анализ изображений с временным разрешением и определяет количество частиц, их морфологию и распределение по размерам, что позволяет следить за развитием тенденций в популяциях.

• Состояние частиц и дисперсных структур непрерывно контролируется по мере изменения условий или параметров эксперимента.
• Наблюдение твердофазного синтеза частиц, иммобилизации ферментов, расщепления и морфологии связанных процессов.
• Измерение массопереноса (K_La) по характеристикам пузырьков.
• Контроль роста кристаллов в ходе периодического или непрерывного биокаталитического процесса в режиме реального времени без необходимости отбора проб.
• Определение условий, влияющих на нуклеацию, осаждение, полиморфизм и другие свойства дисперсной системы.

ReactIR Provides Insight into Optimizing the Synthesis of the Ester

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147

Разрабатывая сложные молекулы, химики ищут способы упростить многоэтапные процессы синтеза. Использование ферментов в качестве катализаторов и при разделении рацемических соединений широко распространено. Аналитические методы in situ дополняют друг друга и очень полезны для оптимизации химических и биохимических превращений на отдельных этапах синтеза.

В этой работе исследователи участвовали в организации синтеза нескольких килограммов препарата арбаклофен плакарбил, применяемого для лечения алкогольной зависимости. Одна из стадий включает синтез важного промежуточного соединения — сложного эфира сукцината и последующее выделение индивидуального (S)-энантиомера. Для получения этого энантиомера в достаточном количестве были исследованы два подхода: препаративная хиральная хроматография и ферментативное разделение. Более выгодным оказался второй метод. Выяснилось, что липаза C. antartica A, иммобилизованная на полиметилакрилате (липаза IMMCALA-T2-150), обеспечивает надежное разделение сложного эфира сукцината.

Для получения этого промежуточного продукта выбрали реакцию тиокарбонатного соединения с сульфурилхлоридом. Ученые использовали погружной зондовый ИК-Фурье спектрометр ReactIR, чтобы оптимизировать выход сложного эфира и свести к минимуму образование побочного продукта. Эксперимент с ИКФС показал, что в реакции тиокарбонатного соединения и сульфурилхлорида образуется промежуточный хлорформиат, имеющий ограниченную термическую стабильность. После образования хлорформиата и до его разложения добавляли N-гидроксисукцинимид, а затем — триэтиламин. Добавление триэтиламина приводило к превращению промежуточного хлорформиата в целевой эфир сукцината с сильным экзотермическим эффектом.

ReactIR Tracks Key Biocarbonate Concentration

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

Авторы выяснили, что ферменты-(де)карбоксилазы дигидроксибензойной кислоты катализируют обратимое региоселективное орто-(де)карбоксилирование фенольных соединений, что представляет значительный интерес, поскольку карбоксилирование с их участием происходит при гораздо более низких значениях температуры и давления, чем при использовании химических катализаторов. В этой публикации сообщается, что (де)карбоксилаза 2,3-дигидроксибензойной кислоты из Aspergillus oryzae действует как катализатор, обеспечивающий орто-карбоксилирование фенольных молекул, и что это связано с одновременным превращением вспомогательного субстрата CO₂ в бикарбонат, которое замедляется амином.

Авторы делают вывод, что природа субстратного кофактора CO₂ или его гидратированной формы — бикарбоната — важна для ферментативного карбоксилирования, поскольку фактический агент карбоксилирования определяется механизмом связывания и активации субстрата. В этой работе для отслеживания образования бикарбоната использовали зондовый ИК-Фурье спектрометр ReactIR, оснащенный погружным датчиком НПВО с алмазным кристаллом. По результатам исследования сообщается о разработке условий реакции, которые значительно улучшают как конверсию, так и скорость реакции биокаталитического карбоксилирования катехола.

ReactIR Investigates Oxidative Coupling With Various Substrates and Aids in Optimizing Reaction Conditions

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599.

Авторы сообщают об исследовании возможности использования грибкового фермента, лакказы (Novozym 51003), в реакциях окислительного сочетания с образованием связи C — C в фенольных соединениях. Имеются сообщения о применимости лакказы для окисления фенолов, анилинов и других соединений в хиноны с восстановлением O₂ до воды. Окислительное сочетание с участием лакказы принято считать неселективным, поэтому авторы исследовали воздействие лакказы на процессы окисления в различных фенольных субстратах для определения эффективности и селективности связи C — C. Исследование показало, что окислительная димеризация 2,6-дизамещенных фенолов может быть не только высокоизбирательной, но и значительно более продуктивной. Продукт окисления 2,6-диизопропилфенола легко восстанавливается до аналогичного бифенольного соединения.

В этом исследовании авторы сначала выбрали целевые субстраты, измеряя содержание кислорода в ходе окисления, инициированного лакказой. Затем они использовали погружной зондовый ИК-Фурье спектрометр ReactIR для исследования эффективности и селективности инициированного лакказой сочетания на конкретных фенольных субстратах, а также для нахождения оптимальных условий для получения максимального выхода продукта. ИК-Фурье-спектрометрия in situ показала, что региоселективный симметричный синтез дихинона происходит довольно быстро. Кроме того, ИКФС in situ позволяет контролировать полимеризацию, происходящую в результате окисления с участием лакказы. При этом полимерные осадки не мешают измерению, поскольку метод НПВО-ИК-Фурье позволяет отслеживать только растворенные аналиты.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics, T., McIntosh, J. A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M. A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N. A., Murphy, G., Maloney, K. M., & Fier, P. S., Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
• Gan, J., Peng, Y., Chen, Q., Hu, G., Xu, Q., Jin, L., & Xie, H. (2020). Reversible covalent chemistry of carbon dioxide unlocks the recalcitrance of cellulose for its enzymatic saccharification. Bioresource Technology, 295, 122230. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.122230
• Huffman, M. A., Fryszkowska, A., Alvizo, O., Borra-Garske, M., Campos, K. R., Canada, K. A., Devine, P. N., Duan, D., Forstater, J. H., Grosser, S. T., Halsey, H. M., Hughes, G. J., Jo, J., Joyce, L. A., Kolev, J. N., Liang, J., Maloney, K. M., Mann, B. F., Marshall, N. M., …Yang, H. (2019). Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science, 366(6470), 1255–1259. https://doi.org/10.1126/science.aay8484
• Nguyen, T. C., Anne-Archard, D., Cameleyre, X., Lombard, E., To, K. A., & Fillaudeau, L. (2019). Bio-catalytic hydrolysis of paper pulp using in- and ex-situ multi-physical approaches: Focus on semidilute conditions to progress towards concentrated suspensions. Biomass and Bioenergy, 122, 28–36. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.01.006
• Thompson, M. P., Peñafiel, I., Cosgrove, S. C., & Turner, N. J. (2018). Biocatalysis Using Immobilized Enzymes in Continuous Flow for the Synthesis of Fine Chemicals. Organic Process Research & Development, 23(1), 9–18. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.8b00305
• Hugentobler, K. G., Rasparini, M., Thompson, L. A., Jolley, K. E., Blacker, A. J., & Turner, N. J. (2017). Comparison of a Batch and Flow Approach for the Lipase-Catalyzed Resolution of a Cyclopropanecarboxylate Ester, A Key Building Block for the Synthesis of Ticagrelor. Organic Process Research & Development, 21(2), 195–199. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.6b00346
• Pečar, D., & Goršek, A. (2017). Process and kinetic characteristics of glucose oxidation catalyzed with immobilized enzyme. Reaction Kinetics, Mechanisms and Catalysis, 122(1), 43–51. https://doi.org/10.1007/s11144-017-1202-2
• Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO₂ as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates. Biotechnology Journal, 12(12), 1700332. https://doi.org/10.1002/biot.201700332
• Gundersen, M. T., Tufvesson, P., Rackham, E. J., Lloyd, R. C., & Woodley, J. M. (2016). A Rapid Selection Procedure for Simple Commercial Implementation of ω-Transaminase Reactions. Organic Process Research & Development, 20(3), 602–608. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.5b00159
• Hilterhaus, L., Liese, A., Kettling, U., & Antranikian, G. (2016). Applied Biocatalysis: From Fundamental Science to Industrial Applications (1st ed.). Wiley-VCH.
• Kartnaller, V., Junior, I. I., de Souza, A. V. A., Costa, I. C. R., Rezende, M. J. C., da Silva, J. F. C., & de Souza, R. O. M. A. (2016). Evaluating the kinetics of the esterification of oleic acid with homo and heterogeneous catalysts using in-line real-time infrared spectroscopy and partial least squares calibration. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 123, 41–46. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2015.09.015
• Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2015.05.011
• Ravelo, M., Fuente, E., Blanco, Á., Ladero, M., & García-Ochoa, F. (2015). Esterification of glycerol and ibuprofen in solventless media catalyzed by free CALB: Kinetic modelling. Biochemical Engineering Journal, 101, 228–236. https://doi.org/10.1016/j.bej.2015.06.002
• Gebhard, J., Sellin, D., Hilterhaus, L., & Liese, A. (2013). Online Analysis of Enzymatic Polycondensation Reactions in Bubble Column Reactors by Means of ATR-FTIR Spectroscopy. Chemie Ingenieur Technik, 85(7), 1016–1022. https://doi.org/10.1002/cite.201200248
• Costa, I. C. R., Leite, S. G. F., Leal, I. C. R., Miranda, L. S. M., & Souza, R. O. M. A. (2011). Thermal effect on the microwave assisted biodiesel synthesis catalyzed by lipases. Journal of the Brazilian Chemical Society, 22(10), 1993–1998. https://doi.org/10.1590/s0103-50532011001000022
• Troiani, V., Cluzeau, J., & Časar, Z. (2011). Application of Chemoselective Pancreatin Powder-Catalyzed Deacetylation Reaction in the Synthesis of Key Statin Side Chain Intermediate (4R,6S)-4-(tert-Butyldimethylsilyloxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydropyran-2-one. Organic Process Research & Development, 15(3), 622–630. https://doi.org/10.1021/op100341m
• Müller, J. J., Neumann, M., Scholl, P., Hilterhaus, L., Eckstein, M., Thum, O., & Liese, A. (2010). Online Monitoring of Biotransformations in High Viscous Multiphase Systems by Means of FT-IR and Chemometrics. Analytical Chemistry, 82(14), 6008–6014. https://doi.org/10.1021/ac100469t
• Gäb, J., Melzer, M., Kehe, K., Richardt, A., & Blum, M.-M. (2009). Quantification of hydrolysis of toxic organophosphates and organophosphonates by diisopropyl fluorophosphatase from Loligo vulgaris by in situ Fourier transform infrared spectroscopy. Analytical Biochemistry, 385(2), 187–193. https://doi.org/10.1016/j.ab.2008.11.012
• Trevisan, M. G., & Poppi, R. J. (2008). Direct determination of ephedrine intermediate in a biotransformation reaction using infrared spectroscopy and PLS. Talanta, 75(4), 1021–1027. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2007.12.050
• Kazarian, S. G. (2007). Enhancing high-throughput technology and microfluidics with FTIR spectroscopic imaging. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 388(3), 529–532. https://doi.org/10.1007/s00216-007-1193-3
• Iwaki, H., Wang, S., Grosse, S., Bergeron, H., Nagahashi, A., Lertvorachon, J., Yang, J., Konishi, Y., Hasegawa, Y., & Lau, P. C. K. (2006). Pseudomonad Cyclopentadecanone Monooxygenase Displaying an Uncommon Spectrum of Baeyer-Villiger Oxidations of Cyclic Ketones. Applied and Environmental Microbiology, 72(4), 2707–2720. https://doi.org/10.1128/aem.72.4.2707-2720.2006
• Yang, J., Lorrain, M.-J., Rho, D., & Lau, P. C. K. (2006). Monitoring of Baeyer-Villiger biotransformation kinetics and fingerprinting using ReactIR 4000 spectroscopy. Industrial Biotechnology, 2(2), 138–142. https://doi.org/10.1089/ind.2006.2.138
• Dadd, M. R., Sharp, D. C. A., Pettman, A. J., & Knowles, C. J. (2000). Real-time monitoring of nitrile biotransformations by mid-infrared spectroscopy. Journal of Microbiological Methods, 41(1), 69–75. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(00)00138-x
• Kohen, A., & Klinman, J. P. (2000). Protein Flexibility Correlates with Degree of Hydrogen Tunneling in Thermophilic and Mesophilic Alcohol Dehydrogenases. Journal of the American Chemical Society, 122(43), 10738–10739. https://doi.org/10.1021/ja002229k