Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов может производиться либо ферментативным путем через расщепление более крупных биомолекул, либо путем направленного химического синтеза. В последнем случае синтез олигонуклеотидов представляет собой химический процесс, в ходе которого образуются нуклеозидные амидофосфиты — основной мономерный элемент олигонуклеотидов. Нуклеозидные амидофосфиты (также для краткости называемые нуклеозидами или амидитами) сами по себе являются производными природных или синтетических нуклеозидов.

Таким образом, нуклеотиды — это сложные молекулы, состоящие из нуклеозида и фосфатной группы, соединенных ковалентной связью. Для образования требуемого продукта нуклеотиды соединяются в определенную последовательность. Так, олигонуклеотиды состоят из коротких сегментов нуклеиновых кислот, соединенных друг с другом с образованием одноцепочечных биополимеров. Поскольку большинство олигонуклеотидов, как правило, включают до 20 соединенных нуклеотидов (хотя их может быть и больше), то их можно рассматривать как небольшие биомолекулы. 

Как и синтез других небольших молекул, используемых в фармакологии, синтез олигонуклеотидов требует тщательного контроля температуры, pH, качества субстратов и т. д. При использовании стандартных методик синтеза олигонуклеотидов чем длиннее и сложнее последовательность нуклеотидов, тем труднее достичь требуемых выхода, чистоты и себестоимости продукта. Для решения этих задач применяются процессно-аналитические технологии (PAT).

Олигонуклеотиды — это короткие одно- или двухцепочечные сегменты нуклеиновых кислот, которое при соединении друг с другом образуют одноцепочечные биополимеры. Спаренные основания нуклеотидов можно рассматривать как эквиваленты мономеров, образующих классические химические полимеры. Нуклеотид состоит из трех элементов: азотсодержащего основания, молекулы сахарозы с пятью атомами углерода (эти два элемента образуют нуклеозид) и одной или нескольких фосфатных групп. С другой стороны, нуклеотиды могут состоять из неприродных или неканонических оснований. Среди типичных примеров можно назвать ЗНК (запертые нуклеиновые кислоты), морфолиновые олигонуклеотиды и видоизмененные основания или каркасы молекул. 

Сложные последовательности нуклеотидов образуют важные биомолекулы РНК и ДНК. В случае РНК, являющейся одноцепочечным биополимером, место сахарозы занимает рибоза. В состав двухцепочечной молекулы ДНК входит дезоксирибоза. Структурными элементами важных олигонуклеотидов являются короткие последовательности дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот. Определенные последовательности этих нуклеотидов образуют целевые биомолекулы, используемые для биологических, медицинских, криминалистических и клинических задач. 

Олигонуклеотидные праймеры и зонды

Наиболее широко синтетические олигонуклеотиды используются для создания сравнительно коротких зондов и праймеров (до 30 мономерных звеньев), которые применяются во многих сферах. Для этого требуется синтез последовательностей нуклеотидов, парных или обратнокомплементарных к более крупной целевой ДНК или РНК (целевая последовательность). В качестве праймеров олигонуклеотиды широко используются для инициации ферментативных реакций, например при создании миллионов и миллиардов копий коротких или длинных целевых последовательностей. Хорошо известные примеры — полимеразная цепная реакция (ПЦР) и метод секвенирования по Сэнгеру. Олигонуклеотидные праймеры используются при секвенировании ДНК, экспрессии генов, в клонировании и молекулярной диагностике.

В качестве зондов олигонуклеотиды используются для идентификации и связывания с отдельными целевыми последовательностями ДНК и РНК в целях подтверждения присутствия данных последовательностей в конкретном материале. В качестве зондов олигонуклеотиды используются в процедурах блоттинга, таких как нозерн-блоттинг (для РНК) и Саузерн-блоттинг (для ДНК). В сопряжении с флуорофорами в микроматрицах они применяются для контроля изменений при экспрессии генов; другие области применения — скрининг генетических заболеваний и выявление особых патогенов (молекулярная диагностика).

Терапевтические средства, содержащие олигонуклеотиды, и генная терапия

В сфере медицины антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), обычно включающие 20–30 мономерных звеньев, благодаря своей естественной природе используются для ингибирования или выключения (разрушения) генов в нежелательных или сверхактивных последовательностях РНК, что, в свою очередь, блокирует экспрессию конкретных поврежденных или сверхактивных белков, могущих вызвать заболевания или способствовать их развитию. Исследования терапевтических средств, содержащих олигонуклеотиды, заметно ведутся все более интенсивно, и в последние годы было одобрено к применению нескольких новых лекарств.

Будущее синтетических нуклеотидов: изучение разновидностей ДНК- и РНК-вакцин

Не являясь олигонуклеотидами в строгом понимании этого термина, ДНК- и РНК-вакцины, основанные на использовании мРНК, плазмидных или вирусных векторов с нуклеиновыми кислотами длиной во много сотен или тысяч оснований, представляют самые передовые технологии, в которых применяются синтетические нуклеотиды.

Предполагается, что благодаря ДНК- и РНК-вакцинам исчезнет необходимость использовать ненужные или вредные компоненты патогенных бактерий и вирусов. Вместо этого вакцина на основе нуклеиновых кислот должна содержать код только нескольких компонентов ДНК или РНК патогена. Эти цепочки ДНК и РНК должны «научить» иммунную систему пациента производить индивидуальные антигены или фрагменты патогена. С помощью современных вычислительных систем и компьютерного моделирования такие вакцинные продукты на основе олигонуклеотидов возможно создавать в течение нескольких дней или недель при наличии соответствующей целевой последовательности, против которой направлена вакцина. В качестве платформенной технологии вакцины на основе нуклеиновых кислот используют стандартные наборы структурных элементов, которые служат исходным материалом и могут быть организованы в бесчисленное количество произвольных комбинаций. Такие вакцины также сравнительно дешевы и просты в производстве по сравнению со стандартными вакцинными продуктами. Однако это все еще развивающаяся модель для биофармацевтической промышленности, в рамках которой все время решаются новые и новые проблемы. Некоторые трудности уникальны для продуктов на основе олигонуклеотидов и длинноцепочечных нуклеиновых кислот, а некоторые являются общими для всех биотерапевтических продуктов.

Синтез олигонуклеотидов — это химический процесс, при котором нуклеотиды соединяются определенным образом с целью создания вещества с заданной их последовательностью. Для получения олигонуклеотидов широко используется непрерывный синтез в твердой фазе с применением насадочных колонн. В некоторых случаях проводится циклическая реакция с осадком.

Процесс получения целевой последовательности олигомеров протекает за несколько циклов, состоящих из отдельных стадий синтеза. На первой стадии из нуклеотида на твердой подложке удаляется 4,4'-диметокситритильная защитная группа. Затем активируется мономер амидофосфита и быстро связывается со свободной гидроксильной группой на нуклеотиде на твердой подложке с образованием динуклеозида, содержащего фосфиттриэфирную связь. На третьей стадии происходит окисление фосфиттриэфира. На последней стадии (первого цикла) все непрореагировавшие нуклеозиды на подложке блокируются посредством ацетилирования, чтобы предотвратить образование нежелательных побочных продуктов в следующем цикле.

Длина олигонуклеотида определяется числом нуклеотидов, составляющих последовательность. Согласно номенклатуре последовательность длиной в 20 нуклеотидов определяется как «двадцатимер». Длина олигонуклеотида играет важнейшую роль в различных областях применения. Например, короткомерные олигонуклеотиды широко используются в ПЦР, в то время как очень длинные последовательности (200 оснований и более) применяются для таких сложных задач, как клонирование и редактирование с помощью CRISPR. Синтез специализированных длинномерных олигонуклеотидов — сложный процесс, а получение чистой последовательности требует наличия эффективной системы управления синтезом и применения методов очистки. В среднем большинство олигонуклеотидов имеют длину менее 60 мономерных звеньев. Поскольку процесс синтеза олигонуклеотидов требует повторения реакционных циклов с добавлением новых нуклеотидов, то чем больше требуемая длина последовательности, тем больше вероятность образования нежелательных побочных продуктов, которые могут включать удаляемые или отсекаемые последовательности.

В зависимости от требуемого качества, количества и себестоимости продукта используют различные методы очистки. Например, побочные продукты химического синтеза бессолевых олигонуклеотидов удаляются, но нарушения последовательностей остаются. Получение обессоленных олигонуклеотидов выгодно с точки зрения цены и эффективности для многих повседневных задач, таких как ПЦР.  Для более сложных задач применяется метод хроматографии с обращенной фазой, с помощью которого из конечного продукта удаляются нежелательные последовательности. Однако этот метод не так эффективен, как электрофорез в геле, позволяющий получать продукт с последовательностями высокой степени очистки, но, как правило, в небольшом количестве. В клинической области применения постоянной проблемой является поддержание выхода продукта на стадии синтеза и на стадии выделения целевого продукта.

Классический химический синтез в твердой фазе обычно подразумевает использование полимеров или специальных стеклянных гранул, не подверженных влиянию условий реакции. Эти гранулы могут находиться в колоннах, через которые пропускаются реактанты, реагенты и растворители. Назначение гранул состоит в том, чтобы действовать в качестве подложки, на которой молекулы субстрата создают ковалентную связь и затем вступают в химическую реакцию. Установление и снятие защиты с определенных функциональных групп в молекуле субстрата является ключевым фактором процесса синтеза и получения целевого продукта. Продукт синтеза удаляется посредством разрыва связи между ним и полимерной гранулой подложки. 

Твердофазный синтез позволяет быстро получать очищенный продукт, поскольку примеси и непрореагировавшие материалы удаляются на различных стадиях синтеза. Кроме того, весь процесс синтеза можно компьютеризировать и автоматизировать.  Твердофазный синтез — это наиболее широко распространенный метод, применяемый для индивидуального синтеза пептидов и олигонуклеотидов. В последнем случае необходимо использовать множество повторяющихся циклов для последовательного добавления нуклеотидов с образованием целевой последовательности. 

Синтез олигонуклеотидов в твердой фазе сопряжен с рядом проблем, среди которых уменьшение выхода по мере увеличения длины цепи. В качестве предполагаемой причины низкого выхода часто рассматривается механизм стерической изоляции, при котором одна или несколько молекулярных цепей, закрепленных на поверхности, могут препятствовать каждой последующей элонгации соседней цепи. 

Для решения этой и других проблем применяются различные методы синтеза олигонуклеотидов в жидкой фазе. 

Многие из основных стадий жидкофазного синтеза аналогичны соответствующим стадиям твердофазного синтеза. Основное отличие заключается в том, что этот тип синтеза протекает в растворе или жидкой фазе (то есть закрепление на какой-либо поверхности ОТСУТСТВУЕТ). Поскольку этот процесс также цикличен, то применяется несколько сопутствующих методов удаления непрореагировавших реагентов в процессе получения олигонуклеотидного продукта с увеличенной длиной.

Технология использования ПЦР для синтеза олигонуклеотидов была предложена в 1985 году. В 1986 году состоялось первое использование ДНК-полимеразы Taq . Тем не менее промышленное внедрение ферментативного синтеза олигонуклеотидов задерживалось по трем основным причинам:

1. Ферментативный синтез требует наличия матрицы, на которой может действовать фермент ДНК-полимераза, удлиняющий последовательность. Следовательно, самостоятельный синтез олигонуклеотидов с использованием ферментов не может протекать без матрицы. 
   
2. Многие олигонуклеотидные праймеры, зонды и мишени АСО, которые могли бы быть использованы в качестве матриц, сами по себе имеют слишком малую длину, чтобы эффективно подготавливать и запускать процесс полимеразного синтеза.
   
3. Многие искусственные олигонуклеотиды медицинского назначения химически модифицированы для обеспечения пролонгированного периода полувыведения и расширения функциональных возможностей гуморального механизма. Эти модификации почти или полностью исключают взаимодействие таких олигонуклеотидов с эволюционно возникшими полимеразами (это в основном относится к разновидностям олигонуклеотидов большей длины, таким как мРНК).

Продолжаются научно-исследовательские разработки по конструированию полимеразы для применения при синтезе АСО с использованием химически модифицированных групп нуклеотидов.

Процесс синтеза олигонуклеотидов, имеющий комплексный характер, требует высокой степени контроля, понимания механизмов реакций и возможных отклонений, а также эффективного управления. Анализ в режиме реального времени с использованием процессно-аналитической технологии (PAT) помогает минимизировать или полностью исключить использование трудоемких и медленных методов автономного анализа.

• Для изучения кинетики реакций в процессе синтеза олигонуклеотидов и для сравнения циклов можно использовать системы ReactIR и ReactRaman.
• Точный контроль температуры, режима перемешивания и дозирования обеспечат автоматические рабочие станции синтеза EasyMax; ПО  iC с интегрированными средствами контроля тенденций и механизмов реакций облегчает сбор данных и упрощает управление процессом.

James W. Rydzak, David E. White, Christian Y. Airiau, Jeffrey T. Sterbenz, Brian D. York, Donald J. Clancy, Qunying Dai, Real-Time Process Analytical Technology Assurance for Flow Synthesis of Oligonucleotides, Organic Process Research and Development (2015), 19, 203–214.

Авторы отмечают, что, хотя протоколы для автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов хорошо разработаны, химия этого процесса остается сложной и дорогостоящей. Среди ключевых рисков, выявленных при промышленном проведении синтеза, упомянуты следующие:

• подвод ненадлежащего химического раствора к конкретному входному отверстию установки для синтеза;
• количественные ошибки при составлении раствора;
• ошибки, которые могут быть вызваны механическими и другими неустановленными источниками, связанными с установкой для синтеза.

Если хоть один из этих рисков не устранен, может быть нарушен весь процесс. Для решения этих проблем была проведена оценка методики спектроскопического мониторинга в реальном масштабе времени в сочетании с дискриминантным, количественным моделированием и многомерным статистическим контролем процессов на основе данных, полученных в среднем инфракрасном диапазоне. Было установлено, что погружной зондовый ИК-Фурье спектрометр ReactIR позволяет контролировать процесс синтеза в режиме реального времени. Это ценная возможность автоматизировать синтез олигонуклеотидов. В частности, чувствительность, информативная глубина, широкий охват и практическое удобство этого подхода делают его пригодным для решения большого числа ключевых производственных задач, связанных с данным типом веществ. Среди таких задач не последнюю роль играет оперативное подтверждение получаемой последовательности и ее чистоты.

Возможности контроля поточных химических процессов в режиме реального времени, обеспечиваемые ИК-Фурье и рамановской спектроскопией in situ, подтверждены обширной практикой и пригодны для использования на ключевых стадиях синтеза олигонуклеотидов.

• Синтез нуклеотидных мономеров с обеспечением надлежащей структуры и чистоты.
• Сокращение рисков, связанных с механическими неисправностями установки синтеза и неправильной подачей раствора.
• Отслеживание реакции связывания мономера амидофосфита со свободной гидроксильной группой в нуклеотиде на твердой подложке.
• Отслеживание процесса денатурации и отжига комплементарных олигонуклеотидов при двухцепочечном синтезе.
• Определение кинетики химических реакций в процессе отжига — идентификация и отслеживание промежуточных и неизвестных продуктов реакции.
• Установление корреляций между спектрами и ключевыми точками процесса.
• Подход применим к твердофазному, циклическому и конвергентному синтезу пептидов (твердофазный синтез + синтез в жидкой фазе).

Управляемость синтеза важна для обеспечения требуемого результата реакции. Автоматизированные реакторные платформы обеспечивают точность и постоянство всех критических параметров процесса.

• Воспроизводимость условий — фундаментальный принцип науки
• Сочетание данных от датчиков и встроенного процессно-аналитического оборудования позволяет оценить влияние параметров процесса на критические показатели качества.
• Ведение протоколов и автоматизация сводят к минимуму риски и несоответствия, связанные с ручным выполнением операций.
• Данные могут быть представлены в структурированном виде с возможностью поиска.
• Надежность подтверждена множеством упоминаний в публикациях и опытом масштабирования.
• Подход применим к твердофазному, циклическому и конвергентному синтезу пептидов (твердофазный синтез + синтез в жидкой фазе).