生物加工中的病毒灭活

病毒灭活是专门用于提高生物治疗产品安全性的第一步（通常为两步）。 在灭活过程中，将存在于混合和半纯化治疗悬浮液中的任何病毒故意破坏或突然变为非致病性，通常采用的方法是：改变病毒周围环境，从而使病毒结构发生不可逆的破坏与变性。

通常通过改变病毒周围环境，从而使病毒结构发生不可逆的破坏与变性来实现（例如：采用化学、物理甚至是能量方法）。 病毒清除是独立的，并且与病毒灭活不同，因为它是补充性过程，可通过从目标蛋白或产品中消除或分离病毒来进一步提高病毒安全性。

许多生物治疗产品在生产或加工过程中会包含病毒，或者有可能受到病毒污染。 这些方式中的致病性和病毒载量或病毒数量需要通过灭活和清除的方式消除或清除，以防止伤害患者；单独采取任何一个过程通常都是不够的。 根据病毒的具体特征和生物治疗产品的类型，可以使用多种病毒灭活和去除方法。 许多生物治疗加工流程会将补充性方法相结合，以扩大可足以消除的病毒谱。

灭活
病毒灭活的方法有多种。 最常见的方法是：

• 基于低pH的方法——尤其对于单克隆抗体（mAb）之类的生物治疗产品
• 基于溶剂或表面活性剂的方法——通常用于多糖

较少使用的病毒灭活方法包括巴氏灭菌法，干热法和蒸气热法——特别是针对血液或血清产品。

病毒清除
有据可查的病毒清除方法包括沉淀，层析和纳米过滤。

对病毒灭活和清除方法的选择取决于所制备生物治疗产品的大小、类型和易变性、制造商希望使用的纯化方法以及相关病毒的性质和滴度。 原料药（DS）的结构和功能与病毒安全性一样，是同等重要的质量属性，必须始终进行评估和保持。 任何病毒灭活方法（基于低pH或表面活性剂的方法）都可以从精确和同步控制多个关键过程参数（CPP）中受益；这是一种有效了解过程本身以及对原料药（DS）产生的影响所需的能力。 化学合成反应器支持在定义的参数空间内映射现代过程和一致的操作，同时还可以对方法转移和放大生产进行建模。

众所周知，生物治疗产品的低pH病毒灭活会受到pH、时间、温度、蛋白含量以及溶剂或缓冲液含量的影响。 在pH 5.0——5.5条件下，会对许多病毒造成不可逆的变性和将其有效破坏。 根据灭活和清除的目标病毒范围，此范围可能足够。 然而，多种包膜病毒只有在pH范围3.5——4时才能有效灭活。

许多mAb生物治疗产品需要对多种病毒进行广谱清除，因此通常使用3.5——4的“低” pH目标（图A）。 但是，长时间暴露在此pH范围内也会破坏或灭活某些生物治疗产品，特别是蛋白或酶，例如：血液蛋白，胰岛素等（图B）。 随着长时间暴露于pH应力，蛋白和酶会发生严重的脱酰胺、变性和聚集。 免疫球蛋白溶液（包括IgG和IgM mAb）通常在pH 3.5——5.5时不如其他蛋白或酶敏感，尽管它们不同程度上仍然敏感。 在病毒灭活条件下经过足够的时间后，应有效地将传染性病毒数量减至最小，但是不会以物理方式清除残留的病毒颗粒、碎片或其他成分（图C）。

对于免疫球蛋白mAb产品，低pH是最常用的病毒灭活方法，因为此方法相对简单、占地面积小并且通常不需要干预或者附加步骤即可清除，这与表面活性剂或其他溶剂不同。 但是，适合和最佳条件会因分子以及所需的病毒清除谱有所不同。 因此，必须对每个分子进行研究，以表征和验证可进行有效病毒灭活的设计空间或操作边界。 病毒灭活过程的这些边界和结果通常由影响病毒灭活结果，并因此影响药物质量（DS）质量的变量或关键过程参数（CPP）的全部或至少一部分定义。 识别和浏览这些因素将对产品的质量和数量产生积极影响。

以往，低pH病毒灭活研究是使用一定量和浓度的免疫球蛋白溶液，并且在具有磁力搅拌功能的容器（例如：烧杯）内进行的。 由于大多数研究材料将使用起始pH接近生理条件的免疫球蛋白溶液，因此病毒灭活研究将试图说明试剂添加参数。 通常，通过使用滴定管或移液器进行手动滴定，同时间歇地记录pH测量值。 在足以灭活目标病毒含量的低pH条件下完成规定的时间和其他参数保持后，会将原料药（DS）或免疫球蛋白溶液从低pH范围反向滴定至适当的生理或弱碱性范围内。 这通过低pH保持来完成病毒灭活。 尽管如此，在关于病毒灭活的整个低pH滴定研究中，需要通过样品提取进行离线分析，以记录各种质量属性，例如：通过尺寸交换色谱法（SEC）等方法进行聚集或脱酰胺。 尽管熟练的科研人员可以做到精确，但是病毒灭活过程通常很费力，并且会出现自然变化、结果不准确以及任何手动过程在可重现性方面遇到的挑战。

尽管下游生物加工过程中低pH病毒灭活研究的主要需求是确定试剂添加的范围和过程所需的时间，但是过程动力学的表征以及混合过程参数的影响也很重要，最终会成为确保病毒灭活过程的设计既可靠又优化的一项要求。 然而，在病毒灭活过程开发研究中，温度监测和控制往往被忽略，因此成为了一种不受控制的参数。

造成这种疏忽的一部分原因有可能是使用试点或者商业生产规模系统，这些系统在可能记录但无法控制温度的贮存容器或转运容器中进行病毒灭活。 规模的代表性，尤其是混合的代表性通常是在低pH病毒灭活研究（例如：通过由磁力搅拌板控制的手动平台进行的研究）中容易忽略的另一个参数。 由于缺乏对混合一类简单操作的数据捕获功能，因此无法验证研究的假设条件是否正确和一致。 

在对单克隆抗体的下游加工过程中，用于病毒灭活单元操作的低pH处理会对过程中产品聚集造成潜在风险。 在本次由GlaxoSmithKline的Hiren D. Ardeshna进行的演示中，对用于研究四个工艺参数影响性的一种全要素实验设计进行了讨论：

• 低pH终点
• 低pH保持时间
• 低pH滴定持续时间
• 中和滴定持续时间

溶剂或洗涤剂病毒灭活方法通常用于包膜病毒。 使用的试剂通常对治疗蛋白或抗体的易变性产生微乎其微的影响，当使用一些低pH方法时，这些物质会遭受变性或脱酰胺作用。 用于病毒灭活的溶剂或去洗涤剂处理方法与低pH方法具有许多相同的需求和驱动因素：主要是为了确定试剂（在这种情况下为溶剂或洗涤剂）添加的范围以及过程所需时间。 与低pH病毒灭活一样，免疫球蛋白或其他原料药（DS）类型之间的条件有所不同。 因此，必须对每个分子进行研究，以表征和验证可进行有效溶剂或洗涤剂病毒灭活的设计空间或操作边界。 病毒灭活过程的这些边界和结果均由关键过程参数（CPP）定义，包括温度、蛋白含量、溶剂或洗涤剂剂含量、灭活条件下的时间以及溶剂或洗涤剂均质化的混合和有效性。 识别和浏览这些因素将对产品的质量和数量产生积极影响。

尽管洗涤剂病毒灭活研究不需要与低pH研究相同的试剂滴定方式，但仍然需要评估关键变量的设计空间。 与低pH一样，利用溶剂或洗涤剂进行的病毒灭活研究可完全手动表征过程。 试剂加样与控制均取决于同时执行多项关键任务的高度熟练人员的精确性。 溶剂或洗涤剂病毒灭活研究同样会出现自然变化、结果不准确以及在可重现性方面遇到的挑战。

依赖于溶剂或洗涤剂的病毒灭活方法通常需要进一步考虑，而这通常与低pH方法无关。 必须从原料药（DS）或免疫球蛋白溶液中除去所有添加的溶剂或洗涤剂，并通过适当的分析方法进行验证。 通常通过色谱法或通过切向流过滤进行缓冲液交换来去除溶剂或洗涤剂。 去除添加的溶剂或洗涤剂有点类似于从低pH灭活进行反向pH滴定，从而达到适合生理或弱碱性范围的目的。 在规模上，当材料从贮存容器移动通过色谱柱或者用于溶剂或缓冲液交换的其他适合薄膜时，缓冲液交换或色谱方法可能会以连续或半连续的单元操作方式进行。 在过程开发中，溶剂或洗涤剂病毒灭活有可能与随后的纯化或去除步骤分开进行，并且之间有着明显不同。 因此，这种做法会使得数据或信息的连续性变得复杂。

各种疫苗产品都经过病毒灭活，包括类毒素，重组蛋白，亚基，多糖，甚至是少数几种病毒样颗粒疫苗。 另外，选择合适的病毒灭活方法时，需要考虑生物治疗产品的性质以及需要有效清除的病毒广度。

通常，需要对可防止对减毒活疫苗（其中生物治疗产品为病毒颗粒）等疫苗类型造成外部病毒污染的替代方法或做法进行严格考虑。 用于此类产品的特定方法可能包括一种或多种纳米过滤或色谱方法，以有效降低相应原材料来源中的外部病毒载量。 经过灭活或破坏的病毒依然经历适当的低pH或基于溶剂或洗涤剂的病毒灭活过程，这是因为即使病毒产物发生变性或遭受破坏，这种做法依然可保持所需的免疫刺激作用。

用于寡核苷酸产物或分子类型的病毒灭活方法没有被广泛认为是不可或缺的。 这主要与始终不利于病毒的试剂性质、反应条件和加工方法有关。 目前，正在开发和生产的许多此类寡核苷酸产物主要是通过切向流过滤实现的各种缓冲液交换，或者通过各种类型的色谱分离进行纯化、浓缩和配制。

由于人们需要数据连续性和电子批处理记录，因此化学合成反应器在病毒灭活过程中通过设计和执行实验，以及加强数据捕获和可靠性起到力量倍增器的作用。 正交过程分析技术（PAT）将多个应用程序和工作流衔接在一起（例如通过缓冲液交换实现病毒灭活），并且可以对大规模操作的过程流进行更准确建模。

根据自己的时间在办公室或家中观看直播网上演示。

• 按下播放键后即可离开；iC软件可根据反应器内的条件自动响应。 在病毒灭活协议范围内一致地执行操作。
• 从多个传感器捕获数据，包括pH，电导率，氧化还原电位（ORP）和溶解氧。
• 集成外围设备（例如：泵或天平），用于重量法质量传递。

原位FTIR和拉曼光谱法在整个上游、下游、接合和配制单元操作中跟踪关键的生物过程组分。

可以在上游应用中监测葡萄糖和关键代谢物，而在下游过程中，可以实时监控蛋白或疫苗的浓度、稳定剂、赋形剂和杂质，而不会因离线分析造成延迟或成本。

这样可以快速确定过程终点，并清楚地了解各种过程参数对于产品质量和过程效率的影响。