Downstream Processing in der Biopharmazie

Das Downstream Processing (auch als DSP bekannt) von Biopharmaka bezieht sich auf die Gewinnung und Reinigung einer Arzneimittelsubstanz (Drug Substance, DS) aus natürlichen Quellen, wie z. B. tierischen oder bakteriellen Zellen. Das Downstream Processing von Biopharmaka ist in mAb- oder Proteinprozessen sowie bei der Herstellung von Oligonukleotiden, Polysacchariden und verschiedenen Impfstoffen anwendbar.

Das Downstream Processing wird in der Regel so definiert, dass es die Grundverfahren nach Abschluss des Zellwachstums und der Zellvermehrung umfasst sowie ausserdem den Abschluss der Synthesen von Arzneimittelsubstanzen oder anderer Bildungen der Produkte. Der Zweck des Downstream Processing besteht darin, die zuvor synthetisierte Arzneimittelsubstanz oder ein anderes Produkt aus der komplexen Gesamtmatrix zu isolieren, zu reinigen und zu konzentrieren.

Das Downstream Processing kann auch Rezeptierungsaktivitäten umfassen, was den Übergang von der Arzneimittelsubstanz zum Arzneimittelprodukt (Drug Product, DP) bedeutet. Darüber hinaus umfassen die Überlegungen zum Downstream Processing das Ressourcenmanagement und das Management mehrerer Abfallströme und biologischer Gefahren. Aktivitäten des Downstream Processing werden im Labor-, Pilot- und Produktionsmassstab durchgeführt und umfassen Teams für Prozessanalysetechnologie (PAT) und Fertigungswissenschaft und -technologie (Manufacturing Science and Technology, MSAT), die sich auf Prozessoptimierung, Scale-up und Fehlerbehebung konzentrieren. 

Abhängig von der Art des Produkts und der Synthesemethode umfasst das Downstream Processing (DSP) im Allgemeinen eine Kombination der folgenden Schritte:

• Ernte und Filtration
  Die Ernte ist der erste Schritt, um das Produkt vom Rest zu trennen und zugleich die Produktausbeute und -qualität zu optimieren
  
  
• Primäre Erfassung
  Unter Erfassung versteht man das Festhalten am gewünschten Produkt bei gleichzeitiger Minimierung des Zurückbleibens von Verunreinigungen und Nebenprodukten. Es unterscheidet sich von der ‚Ernte‘ dadurch, dass im Wesentlichen sämtliches Restmaterial bereits entfernt wurde.
  
  
• Pufferaustausch und Aufkonzentration
  Die Ultrafiltration (UF) konzentriert einen verdünnten Produktstrom und trennt Moleküle in Lösung auf der Grundlage der Membranporengrösse oder eines Molekulargewichts-Cutoffs. Die Diafiltration (DF) tauscht Produkte aus einem vorhandenen Puffer in einen neuen Puffer für einen Folgeprozess oder einen Puffer für die Endformulierung aus. Ultrafiltration (UF) und Diafiltration (DF) sind in Kombination die Schritte für den Pufferaustausch.
  
  
• Reinigung (und Beseitigung von Kontaminationen oder Verunreinigungen)
  Die Reinigung entfernt Restverunreinigungen mit jeder aufeinanderfolgenden Methode, während gleichzeitig so viel Produkt wie möglich zurückgehalten wird. Ziel ist es, Produktreinheit bei gleichzeitiger Minimierung möglicher Ausbeuteverluste zu erreichen.
  
  
• Biokonjugation (molekülabhängig)
  Biokonjugatmoleküle sind eine neue Klasse oder Generation biologischer Moleküle, die durch die kombinierte Funktion von zwei oder mehr verschiedenen therapeutischen Molekültypen eine erhöhte Wirksamkeit haben sollen. Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (Antibody-Drug Conjugates, ADC) gehören zu den gebräuchlicheren Biokonjugaten und werden durch biochemische Modifikation eines Antikörpers und dessen kovalente Bindung an einen anderen pharmazeutischen Wirkstoff (Actice Pharmaceutical Ingredient, API) synthetisiert.
  
  
• Rezeptierung
  Die Rezeptierung ist der Prozess, der eine Arzneimittelsubstanz (Drug Substance, DS) in ein formuliertes Arzneimittel (Drug Product, DP) überführt. Die Rezeptierung bringt das Produktmolekül aus einer Umgebung, einem Lösungsmittel oder einem anderen physikalischen Zustand in eine für die klinische Verabreichung geeignete Form.

• Tiefenfiltration, Hohlfaser: Abhängig von der Art des Produkts und des Verfahrens umfassen die Ernteverfahren in der Regel Tiefenfiltration (Bild 1) oder Hohlfaserfilter (Bild 2). Bei der Tiefenfiltration wird ein Gemisch durch eine Membran oder eine andere Grenzfläche gepumpt, um in einer flüssigen Suspension Rückstände vom Produkt zu trennen. Hohlfaserfilter werden in kontinuierlichen Bioprozessabläufen verwendet, um die im Überstand exprimierte Arzneimittelsubstanz (DS) zu entfernen, während ein Teil der Biomasse vorübergehend im Hohlfaserfilter zurückgehalten wird. Die akustische Feld-Fluss-Fraktionierung ist eine weitere neue Technik, die derzeit vor allem in Entwicklungsumgebungen zu finden ist. Mit verschiedenen Betriebsarten und Konfigurationen können Ergebnisse erzielt werden:
  • Modulation von keiner Zell- oder Partikeltrennung (Bild 3a)
  • Auswahl der Zell- oder Partikelabtrennung aus den Zufuhrströmen in einen neuen Fangstrom mit Umleitung oder Abtrennung einer zweiten Partikelpopulation (Bild 3b)
  • Verlagerung eines gesamten Partikelsystems in einen neuen Strom und/oder Neuzuordnung von Fluiden, möglicherweise in Rezirkulation (Bild 3c)
  • Hydrodynamische Interaktion, wobei eine modulierte Mischung aus Partikelauswahl und Flüssigkeitsaustausch auftreten kann (Bild 3d)

• Zentrifugation: Eine andere im Bioprocessing weit verbreitete Trennungsmethode ist die Zentrifugation, die angesichts des immer häufiger zu beobachtenden Trends zu hoher bis sehr hoher Gesamtbiomasse und mässiger finaler Dichte lebensfähiger Zellen allerdings immer häufiger als Engpass angesehen wird und für das kontinuierliche Bioprocessing als nicht praktikabel gilt.
  
  
• Säure/Tensid-Lyse, Absorption in organischer Phase: Die Produkttrennung mit Lyse verfolgt in der Regel ein grundlegendes Ziel, nämlich die sequesterierenden Strukturen, die die Arzneimittelsubstanz oder das Produkt enthalten, wirksam zu zerstören und eine physikalische Trennung zwischen eventuellen Ablagerungen oder anderen Verunreinigungen und der Arzneimittelsubstanz zu schaffen. Die Säure- oder Tensidlyse wird fast ausschliesslich bei bakterieller und gelegentlich bei Hefeexpression eingesetzt. In ähnlicher Weise ist die Absorption und das Erfassen eines Produkts in der organischen Phase bei bakteriellen Expressions- und Produktionssystemen am häufigsten und wird gelegentlich für Hefesysteme verwendet.
  
  
• Flockung und Fällung: Dabei handelt es sich um Methoden der aktiven Manipulation von Partikelsystemen, um das Ziel der Trennung zu erreichen. Flockung wird im Allgemeinen als Vorbereitungsmethode vor der Filtration oder Zentrifugation angewandt. Durch Anwenden der Flockung wird ein hoher Durchfluss über die Filtrationseinheiten sowie eine effiziente und kostengünstige Trennung von Zellmaterial aus dem Überstand gewährleistet. Zusätzliche Methoden zur Entfernung des Flockungsmittels sowie Verifizierungsprotokolle können erforderlich sein. Bei der Fällung handelt es sich um eine aktive Partikelmanipulation, die durch veränderte Parameter wie Lösungsmittel oder Ionenstärke ausgelöst wird, um die Löslichkeit zu verringern.
  

Die Partikelgrössenverteilung (Particle Size Distribution, PSD) ist bekanntermassen ein kritischer Prozessparameter (Critical Process Parameter, CPP), der an der Filterkapazität beteiligt ist und wesentlich grössere Auswirkungen hat als die Trübung und der Druck allein. Die Partikelgrössenverteilung (PSD) kann im Laufe der Zeit integriert werden, um die Partikelansammlung auf Filtern (Sonde über Filter) abzubilden und ein Versagen vorherzusagen. Die Partikelgrössenverteilung kann auch unterhalb des Filters gemessen werden, um den Durchbruch von Spuren von Partikeln zu beobachten und ähnliche Ergebnisse zu identifizieren.

Die Methode und Strategie des Erfassens ändert sich je nach Art des Zielmoleküls geringfügig. Im Prinzip werden Antikörper durch Affinitätsharze wie Protein A und Protein G sowie durch einige andere selektiv hergestellte Methoden gebunden. Nicht-Antikörper-Proteine und Oligonukleotide werden häufiger durch Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography, IEX) erfasst. Produkte wie Polysaccharide und komplexe Glykanstrukturen werden häufig mit der Hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) oder der Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed Phase Chromatography, RPC) erfasst.

• Affinitätschromatographie (Protein A/G) ist eine erste chromatographische Methode (in der Regel als Protein A oder ProA bezeichnet), die das interessierende Produkt (typischerweise ein mAb) von anderen löslichen Materialien trennt und konzentriert, indem das Zielprotein über spezifische Bildungswechselwirkungen reversibel an die Säule gebunden oder zurückgehalten wird (Bild a), während die anderen Komponenten durch die Säule „eluieren“ (Bild b). Eine Reihe von Waschschritten, gefolgt von selektiver Elution, setzt dann das Zielmolekül frei (Bild c). Es gibt Bedenken, die bei der Verwendung der Affinitätschromatographie auftreten, z. B. die Maximierung der Bindung des Zielproteins (Säulenlast) an die Affinitätssäule. Viele dieser Probleme werden derzeit durch integrierte UV-Systeme gelöst, die den aktuellen Anforderungen entsprechen, denen aber die Möglichkeiten fehlen, die Methoden wie in-situ-FTIR bieten.
  
  
• Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography, IEX) trennt und konzentriert das interessierende Produkt (Proteine, Oligonukleotide und andere) von anderen löslichen Materialien durch reversible Bildung oder Zurückhalten des Zielmoleküls an die Säule, basierend auf der Stärke der elektrostatischen Wechselwirkung mit dem Festphasenmaterial (Bild d), während die anderen Komponenten durch die Säule „eluieren“. Ionenaustauschchromatographie (IEX) wird regelmässig als zusätzliche oder alternative Aufreinigungsmethode verwendet und ist daher nicht auf Anwendungen in der Erfassungstechnik beschränkt.

Ultrafiltration (UF) wird im Downstream Processing häufig zum Konzentrieren eines verdünnten Produktstroms verwendet. Bei der Ultrafiltration (UF) werden Moleküle in einer Lösung auf der Grundlage der Membranporengrösse oder eines Molekulargewichts-Cutoffs getrennt. Die Diafiltration (DF) wird am häufigsten verwendet, um das Produkt in einen gewünschten Puffer auszutauschen (z. B. von einem Elutionspuffer in einen Puffer für die Endformulierung).

• Ultrafiltration und Diafiltration (zusammen als Pufferaustausch bekannt) verwenden typischerweise die Tangentialflussfiltration (TFF), bei der der Zulauf parallel zur Membranoberfläche und nicht senkrecht zur Oberfläche fliesst. Der Pufferaustausch ist nach wie vor ein sehr manueller Vorgang, der selten optimiert wird. Die Produktkonzentration wird im Allgemeinen durch eine Form der UV-Spektroskopie analysiert, entweder eigenständig, als Detektor für HPLC oder als Methode mit variabler Schichtdicke.

Es gibt eine Reihe von Herausforderungen, die sich im Prozess des Pufferaustauschs ergeben:

• Genaue Verfolgung der Austauschvolumina
• Zuverlässige Prozessvorhersage aus nicht repräsentativen Stichproben
• Verzögerte oder langsame Antwortzeiten von Offline-Messungen
• Kumulativer Produktverlust mit extraktiver Probennahme
• Fortpflanzung der Fehler bei der Probenvorbereitung für Offline-UV- und HPLC-Messungen
• In-situ-IR und Raman-Spektroskopie ermöglichen die gleichzeitige Analyse mehrerer Komponenten mit höherer Präzision und grösserem Dynamikbereich und ohne die mit der Offline-Analyse verbundenen Verzögerungen. 

Es gibt mehrere Methoden, die nacheinander angewendet werden, um die Reinheit der Arzneimittelsubstanz (DS) zu erhöhen, beginnend mit frühen Klärungs- und Extraktionsschritten, gefolgt von einer geeigneten Methode zur Erfassung und ersten Massenisolation, gefolgt von Zwischen- und dann Endstufen der Reinigung, wobei letztere die Polierchromatographie, Nano-/Sterilfiltration, Kristallisation und virale Clearance umfassen.

Durch die Beseitigung von Verzögerungen, die mit der Offline-Analyse verbunden sind, verbessern In-situ-FTIR-Messungen die Polierchromatographie-Schritte, indem sie eine sofortige Rückmeldung zur Quantifizierung und Spezifizierung der Fraktionskomponenten einschliesslich Puffer, Arzneimittelsubstanz und Verunreinigungen während der Zwischenreinigungsschritte liefern. Dies führt zu verbesserten Fraktionsschnitten, Aggregat- oder Fragmentunterscheidung und Gesamtkonzentration in Echtzeit. Für die virale Clearance wird jedes Virus, das in der gepoolten und halb gereinigten therapeutischen Suspension vorhanden ist, absichtlich geschädigt oder abrupt in eine nicht-pathogene Form umgewandelt, in der Regel durch Veränderung der Umgebung des Virus. Die Kontrolle und Verfeinerung dieser kritischen Prozessparameter (Critical Process Parameters, CPP) wird durch automatisierte Reaktorplattformen mit integrierten biophysikalischen Sensoren ermöglicht. Inline-Prozessanalysetechnologie (PAT) ist nützlich für die Charakterisierung von Verunreinigungen in späteren Stadien der Reinigung, da die Konzentrationen dann im Allgemeinen höher sind und es einfacher ist, das Produkt in einer halb gereinigten Matrix zu unterscheiden. 

Biokonjugatmoleküle sind eine neue Klasse oder Generation biologischer Moleküle, die durch die kombinierte Funktion von zwei oder mehr verschiedenen therapeutischen Molekültypen eine erhöhte Wirksamkeit haben sollen. Die Chemie von Biokonjugaten erfordert eine detaillierte Prozesscharakterisierung und -optimierung. Herkömmliche Werkzeuge wie Mikrozentrifugenröhrchen, Bechergläser, Heizplatten, Magnetrührstäbe und Transferpipetten sind nicht mehr in der Lage, die Anforderungen an die Reproduzierbarkeit in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Dosierung, Mischen und andere Parameter zu erfüllen.

Die Biokonjugationschemie beruht auf einer Reihe gut kontrollierter Schritte in der Abfolge, die eine Reduktion funktioneller Gruppen, eine Aktivierung, eine API-Linker-Konjugation an das primäre Biologikum und eine beliebige Anzahl von Wasch- oder Lösungsmittel- bzw. Pufferaustauschschritten umfassen können (siehe Diagramm unten). Biopharmazeutische Wissenschaftler übernehmen die Methodologie, die in der Forschung und Entwicklung kleiner Moleküle verwendet wird, wie z. B. die automatisierten EasyMax Synthesereaktoren. Der EasyMax bietet eine kohäsive Architektur, so dass relevante Prozessparameter wie pH-Wert, Leitfähigkeit, Redoxpotential, Temperatur, Rühren, Dosierung usw. präzise gesteuert und experimentelle Daten genau erfasst werden. Die Automatisierung der Biokonjugationschemie bietet Datenintegration, Korrelation von Prozessereignissen, experimentelle Integrität und Scale-up-Parameter mittels statistischer Versuchsplanung (Design of Experiment, DoE). 

Ziel der Rezeptierung ist es, das Produktmolekül aus einer Umgebung, einem Lösungsmittel oder einem anderen physikalischen Zustand, in eine Form zu bringen, die für die klinische Verabreichung an Menschen akzeptabel ist. Das Produktmolekül wird entsprechend der Art und Weise rezeptiert, wie das Endprodukt verwendet werden soll. Also eine Aufnahme durch Inhalation, Injektion oder orale Verabreichung. Die Langzeitstabilität des Produkts und der zugehörigen Hilfsstoffe wird beurteilt, um sicherzustellen, dass die gemessene Dosis und die kritischen Qualitätsmerkmale (Critical Quality Attributes, CQA) nach Verarbeitung, Lagerung und Versand innerhalb der Spezifikation liegen. Neben der Sterilität ist die Gewährleistung der Entfernung von Verunreinigungen und Endotoxinen und die Verhinderung des Abbaus des Arzneimittels (DP) für die Aufrechterhaltung der Sicherheit und Wirksamkeit während der Herstellung und langfristigen Lagerung eines Proteintherapeutikums von wesentlicher Bedeutung.

Zu den rezeptierten Arzneimittelprodukten gehören Proteine (insbesondere mAb), Polysaccharide, Nanopartikelsysteme, organische Stoffe, Oligonukleotide und die vielen Arten von Impfstoffen. Bestimmte Impfstoffe werden mit einem Adjuvans rezeptiert, typischerweise einem Partikel auf Aluminiumbasis oder einer organischen Emulsion. Insbesondere die Impfstoffrezeptierung und die Adjuvans-Synthese sind Arbeitsabläufe, die gut positioniert sind, um von automatisierten parallelen Reaktor-Workstations, der Workflow-Digitalisierung und einer Integration der orthogonalen Prozessanalysetechnologie (PAT) zu profitieren. Mit der Echtzeit-PAT wird weit mehr Wissen über das, was während des Prozesses geschieht, gewonnen, als nur die Anfangs- und Endpunkte zu analysieren.

• Erkennen von Faktoren, die während der Bioprozessentwicklung zur Bildung von Engpässen und Verunreinigungen beitragen
• Verstehen, inwiefern Prozessbedingungen die Produktkonzentration und die Ausbeute beeinflussen
• Minimierung von Ungenauigkeiten und Zeitverzögerungen, die durch traditionelle, weniger effiziente Produktions- und Analysetechniken entstehen
• Überwachung spezifischer Vorgänge wie Reinigung, Chromatographie, Pufferaustausch, Aufkonzentrierung und Rezeptierung
• Verwendung von Data-Mining-Methoden zur vollständigen Charakterisierung der Beziehung zwischen den verschiedenen Schritten des Downstream Processing und Verwendung dieser verwertbaren Informationen zur Optimierung der Leistung kontinuierlicher Prozesse
• Implementierung einer integrierten Strategie für Quality by Design (QbD)/Prozessanalysetechnologie (PAT)

In diesem Leitfaden wird beschrieben, wie Forscher Prozessanalysetechnologie (PAT) einsetzen, um tägliche Arbeitsläufe zu transformieren und signifikante Verbesserungen im Downstream Processing zu erzielen. Unter anderem werden folgende Themen behandelt:

• Überwachung der Proteinkonzentration
• Prozessoptimierung beim Pufferaustausch
• Zusammensetzung, Verteilung und Morphologie von Impfstoffadjuvantien
• Automatisierung zur Deaktivierung von Viren
• Biokonjugationsprozessentwicklung

Die biopharmazeutische Industrie setzt neue Technologien ein, um durch die erfolgreiche Anwendung kontinuierlicher Verarbeitungsmethoden und die Ermöglichung einer umfassenden Datenerfassung und elektronischen Aufzeichnung einen besseren Einblick in die Prozesse zu erhalten. Mit Hilfe automatisierter Laborreaktoren, Analysegeräten für in-situ-Spektroskopie, Werkzeugen zur Partikelcharakterisierung und fortschrittlicher Software ermöglicht die Prozessanalysentechnik (PAT) eine präzise Steuerung und ein umfassendes Verständnis für die Optimierung von Downstream-Prozessen.

• Ernte und Filtration: ParticleTrack (FBRM) misst die Partikelanhäufung und Grössenverteilung der Zellbrühe, die in die Filter hinein- oder aus ihnen herausfliesst, und kann eine Kapazitätskorrelation oder Rückkopplungssteuerung bereitstellen, um Prozessstörungen zu minimieren. EasyViewer führt eine Bildanalyse durch und extrahiert die Partikelanhäufung, Grössenverteilung und Morphologie aus zeitaufgelösten Inline-Bildern des Prozesses. Wenn er ober- oder unterhalb von Filtern platziert wird, kann der EasyViewer eine Kapazitätskorrelation oder Rückkopplungskontrolle bieten, ist jedoch am wertvollsten, wenn er für die Analyse, Charakterisierung und Morphologie von Grundursachen eingesetzt wird.
  
  
• Primäre Erfassung: Die Schnelligkeit der Probennahme und der LoD für ReactIR sind vorteilhaft für die primäre Erfassungschromatographie, bei der mehrere Messpunkte innerhalb schneller Ereignisse aufgezeichnet werden, während mehrere Komponenten quantitativ differenziert werden. Überwachen Sie variable Zuführungseingänge sowie die Harzqualität und die Lebensdauerleistung. Identifizieren und analysieren Sie Eluent-Komponenten und eliminieren Sie Verzögerungen beim Erhalten von Analyseergebnissen, um datenbasierte Entscheidungen in Echtzeit zu treffen.
  
  
• Pufferaustausch und Aufkonzentration: ReactIR erfasst und quantifiziert mehrere Hilfsstoffe und Arzneistoffspezies (DS) gleichzeitig in Echtzeit. Kontrollieren der Pufferverwendung; Überwachen von Membraneffekten; Verwenden direkter In-situ-Konzentration anstelle von Diavolumen-Näherungen; Erhöhen der Konzentrationsgenauigkeit von +/-5 % auf +/-2 %; Beseitigen analytischer Verzögerungen. Die automatisierten EasyMax-Reaktoren beschleunigen die Prozessentwicklung um bis zu 80 %. Dies gelingt durch eine Erfassung und Strukturierung experimenteller Daten, die genaue Steuerung aller kritischen Prozessparameter (CPP) und die Integration biophysikalischer Sensoren zur Messung von Parametern wie pH-Wert, Leitfähigkeit, Redox und gelöster Sauerstoff (DO)
  
  
• Reinigung: ReactIR ist vorteilhaft zur Unterstützung der Polierchromatographie. Quantifizierung und Spezifizierung von Fraktionskomponenten einschliesslich Puffern, Arzneimittelsubstanz (DS) und Verunreinigungen. Verbessern Sie Fraktionsschnitte, die Unterscheidung von Aggregaten oder Fragmenten und die Gesamtkonzentration in Echtzeit; vermeiden Sie Verzögerungen beim Erhalten von Offline-Analyseergebnissen. Wenn der EasyMax für die Deaktivierung von Viren verwendet wird, können Sie den DoE-Raum einschliesslich Mischbedingungen, Temperaturkontrolle, Dosierungsstrategien und -raten schnell beurteilen. Mildern Sie die Qualitätseinflüsse der pH-induzierten Deamidierung und Denaturierung. Beschleunigen Sie die Prozessentwicklung durch Integration biophysikalischer Sensoren, z. B. für pH-Wert, Leitfähigkeit, Redox und gelösten Sauerstoff. Mit ParticleTrack (FBRM) und EasyViewer wird zur schnellen Prozessoptimierung der Einfluss von Prozessparametern auf die Kristallisation ermittelt.
  
  
• Biokonjugation (molekülabhängig): EasyMax ermöglicht eine schnelle Beurteilung und Feinsteuerung der CPP des DoE-Raums einschliesslich Mischbedingungen, Temperatursteuerung, Dosierungsstrategien und -raten. Eliminieren Sie die experimentelle Variabilität, die mit manuellen Offline-Methoden und schlechter Kontrolle kritischer Prozessparameter verbunden ist. ReactIR und ReactRaman bieten detaillierte mechanistische Informationen in Echtzeit, wodurch Offline-Verzögerungen und Ungenauigkeiten bei der Probennahme vermieden werden.
  
  
• Rezeptierung: EasyMax kontrolliert alle kritischen Prozessparameter und integriert ReactIR, ReactRaman, ParticleTrack, EasyViewer und zahlreiche biophysikalische Sensoren. Charakterisieren Sie die Stabilität von Arzneimittelsubstanzen und Arzneimittelprodukten, die Endkonzentration, die Synthese von Adjuvantien, Polymerisationen, die Verkapselung, Adsorptionen und andere partikuläre Ereignisse.

Der automatisierte EasyMax-Reaktor ist eine komplette Arbeitsstation für die grundlegende Parameteroptimierung beim Entwerfen und Ausführen von Methoden des Downstream Processing (DSP). Dieses vollautomatische System ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Schlüsselvariablen des Bioprocessing.

• Verwalten Sie alle kritischen Prozessparameter (CPPs) einschliesslich der Identifizierung von Reagenz und Ausgangsmaterial, Dosierung, Temperatur, Mischung, pH-Messung und Titration
  
  
• Problemlose Integration mit In-Situ-Analysemethoden wie ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (In-Situ-Bildanalyse) und EasySampler. Lassen Sie Experimente unbeaufsichtigt ablaufen; führen Sie intelligente automatische Probennahmen durch, wenn eine Offline-Analyse erforderlich ist.
  
  
• iC Software ermöglicht die automatisierte Ausführung und Steuerung aller Experimente und Peripheriegeräte sowie die vollständige Datenerfassung und -aufzeichnung

ReactIR verwendet die Spektroskopie im mittleren Infrarotbereich, um wässrige sowie organisch lösliche Komponenten in einem Behälter oder fliessenden Prozessstrom in-situ sowie in Echtzeit zu messen. ReactIR-Messungen werden nicht durch suspendierte Feststoffe, Blasen oder Zellmasse beeinflusst.

• Überwachen Sie mehrere Produktqualitätsattribute in-situ. Beseitigen Sie Verzögerungen im Zusammenhang mit der Probennahme
  
  
• Quantifizieren Sie die Auswirkungen von Verarbeitungsschritten auf Produktausbeute und Prozesseffizienz
  
  
• Bietet umsetzbare Datenanalyse für Entscheidungsfindung und Kontrolle in Echtzeit
  
  
• Unterstützt die ICH-Richtlinien durch datenreiche Experimente und Digitalisierung
  
  
• Hilft beim Scale-up aus Forschung und Entwicklung in die Fertigung
  
  
• Misst Analytkonzentrationen von nur 0,5 mg/ml in Volumina von wenigen Millilitern bis zu Tausenden von Litern

ParticleTrack und EasyViewer ermöglichen Wissenschaftlern Folgendes:

• Kontinuierliche Überwachung von Partikeln und Partikelstrukturen bei wechselnden Versuchsbedingungen
  
  
• Verfolgung des Chargenwachstums biologischer Systeme in Echtzeit, ohne dass eine Probenentnahme erforderlich ist
  
  
• Charakterisierung der Bedingungen von Partikelsystemen, die in die Verarbeitung, z. B. Filtration, gehen oder aus ihr herauskommen
  
  
• Beobachtung von Partikelmechanismen wie Adjuvans-Synthese, Antigen-Adjuvans-Adsorption und Stabilität 

ParticleTrack mit Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-Technologie ist ein sondenbasiertes Partikelanalysegerät , das direkt in einem Gefäss eingeführt wird, um Veränderungen der Partikelgrösse und -anzahl in Echtzeit zu verfolgen. Verwendet Messungen der Verteilung der Partikelsehnenlänge (Chord Length Distribution, CLD) zur Gewinnung der Partikelgrössenverteilung (PSD). 

EasyViewer ist ein optisches, sondenbasiertes Instrument, das direkt in ein Gefäss eingeführt wird, um Bilder des Partikelsystems aufzunehmen. EasyViewer führt eine Bildanalyse durch und extrahiert Partikelanhäufung, Grössenverteilung und Morphologie aus zeitaufgelösten Inline-Bildern des Prozesses, wodurch im Laufe der Zeit eine Trendanalyse von Populationen ermöglicht wird. 

Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl₂ precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.

Die Autoren berichten über die Verwendung von zweiwertigen Kationen, insbesondere ZnCl₂, um monoklonale Antikörper in einem präzipitationsbasierten Verfahren einzufangen und zu reinigen.  Aufgrund der vernetzenden Natur der zweiwertigen Kationen und der Eliminierung von PEG waren die Viskosität des Überstands und die Resolubilisierungs-Verdünnungsfaktoren sehr niedrig.

Indem die ZnCl₂-Konzentration statisch gehalten und der pH-Wert mit Hilfe eines automatisierten EasyMax-Laborreaktors variiert wurde, quantifizierten die Autoren den Einfluss des pH-Wertes auf die Ausbeuten. Die Fällung wurde mit einer ParticleTrack FBRM-Sonde überwacht und die Grössenverteilung der Proteincluster bei den verschiedenen pH-Werten gemessen.  Die Wissenschaftler fanden heraus, dass der optimale pH-Wert für die Fällung ungefähr bei pH 6 und 7 liegt und dass der pH-Wert einen grossen Einfluss auf die Grösse der Fällungscluster hat, wobei die grössten Cluster mit besseren Ausbeuten verbunden sind. Sie geben an, dass die FBRM-Inline-Beobachtung zur Abschätzung der resultierenden Ausbeuten verwendet werden kann. Eine Offline-Messung der tatsächlichen Konzentration während der Fällung ist nicht erforderlich.

Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, ”Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using offline and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.

Da die Wechselwirkung zwischen Antigen und Adjuvans für die Immunogenität des Impfstoffs wichtig ist, untersuchten die Autoren in dieser Arbeit die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Adjuvans, in diesem Fall AlPO₄, wie z. B. Partikelgrösse und chemische Zusammensetzung. Sie verwendeten sowohl Offline-Techniken wie Fourier-Transform-Infrarot- (FTIR) und Raman-Spektroskopie, Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS), Laserbeugung und Inline-Methoden wie in-situ FTIR-ATR (ReactIR), Raman (ReactRaman) und Focused Beam Reflectance Measurements (FBRM, ParticleTrack). Im Hinblick auf die Inline-Messungen wurde die Partikelgrössenverteilung von Aluminiumphosphat und adsorbiertem Protein mittels FBRM untersucht, und die Analyse der Zusammensetzung von Aluminiumphosphat wurde mit der in-situ-ATR-Sonde durchgeführt.

Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die Inline-PAT die Partikelgrösse und chemische Zusammensetzung für die verschiedenen Stufen der Adjuvansherstellung wirksam überwacht.  Ähnliche Ansätze können auch zur Beurteilung der Los-zu-Los-Konsistenz verwendet werden. Sie geben an, dass der Einsatz von Inline-PAT fortschrittliche Fertigungsstrategien wie Echtzeit-Produktfreigabetests unterstützt.

Nachstehend finden Sie eine Auswahl aktueller Publikationen mit Downstream Processing in der Biotechnologie und der biopharmazeutischen Industrie.

• Gregory Dutra, Daniel Komuczki, Alois Jungbauer, Peter Satzer, “Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCl2 precipitation without polyethylene glycol”, Engineering in Life Sciences (2020), 20, 265–274.
  
• Dhanuka P. Wasalathanthri, Matthew S. Rehmann, Yuanli Song, Yan Gu, Luo Mi, Chun Shao, Letha Chemmalil, Jongchan Lee, Sanchayita Ghose, Michael C. Borys, Julia Ding, Zheng Jian Li, "Technology outlook for real‐time quality attribute and process parameter monitoring in biopharmaceutical development—A review", Biotechnology and Bioengineering (2020), 177(10), 3182-3198.
• Carmen Mei, Sasmit Deshmukh, James Cronin, Shuxin Cong, Daniel Chapman, Nicole Lazaris, Liliana Sampaleanu, Ulrich Schacht, Katherine Drolet-Vives, Moriam Ore, Sylvie Morin, Bruce Carpick, Matthew Balmer, Marina Kirkitadze, "Aluminum Phosphate Vaccine Adjuvant: Analysis of Composition and Size Using Off-line and In-Line Tools”, Computational and Structural Biotechnology Journal (2019), 17, 1184-1194.
• Julian Kager, Vladimir Berezhinskiy, Robert Zimmerleiter, Markus Brandstetter, Christoph Herwig, “Extension of a Particle Filter for Bioprocess State Estimation using Invasive and Non-Invasive IR Measurements”, Computer Aided Chemical Engineering (2019), 46, 1417-1422.
• Matthias Brunner, Philipp Brosig, Monika Losing, Marco Kunzelmann, Amandine Calvet, Fabian Stiefel, Jan Bechmann, Andreas Unsoeld, Jochen Schaub, “Towards robust cell culture processes—Unraveling the impact of media preparation by spectroscopic online monitoring”, Engineering in Life Sciences (2019), 19, 666-680.
• Marine Deshors, Olivier Guais, Virginie Neugnot-Roux, Xavier Cameleyre, Luc Fillaudeau, Jean Marie Francois, "Combined in situ Physical and ex-situ Biochemical Approaches to Investigate in vitro Deconstruction of Destarched Wheat Bran by Enzymes Cocktail Used in Animal Nutrition”, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2019), 7(158).
• Steffen Großhans, Matthias Rüdt, Adrian Sanden, Nina Brestrich, Josefine Morgenstern, Stefan Heissler, Jürgen Hubbuch, “In-line Fourier-transform infrared spectroscopy as a versatile process analytical technology for preparative protein chromatography", Journal of Chromatography A, (2018), 1547, 37-44.
• Anja Lemoinea, Frank Delvigneb, Anika Bockischa, Peter Neubauera, Stefan Junne, “Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions”, Journal of Biotechnology (2017), 251, 84-93.
• Anouk Dirksen, Keith A. Davis, Joe T. Collins, Keshab Bhattacharya, Jari I. Finneman, Erin L. Pepin, Jeffrey S. Ryczek, William B. Wellborn, Ratish Mangalathillam, Brad P. Evans, Mark J. Pozzo, Rory F. Finn, “Process development of a FGF21 protein–antibody conjugate”, Peptide Science (2017), 110:e23042.
• Cosima Koch, Andreas E. Posch, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Comparison of Fiber Optic and Conduit Attenuated Total Reflection (ATR) Fourier Transform Infrared (FT-IR) Setup for In-Line Fermentation Monitoring”, Applied Spectroscopy (2016), 70(12), 1965-1973.
• Andrew Salazar, Julia Bleifuß, Anke Simon, Sabrina Schüßler, Michael Keusgen, Nikolai Stankiewicz, Jörg von Hagen, “Compaction of chemically defined cell culture media increases its dissolution rate through an increase of solvent accessible surface area”, Powder Technology (2016), 301, 110-117.
• Patricio Lopez-Exposito, Angeles Blanco Suarez, Carlos Negro, “Estimation of Chlamydomonas reinhardtii biomass concentration from chord length distribution data”, Journal of Applied Phycology (2016), 28, 2315–2322.
• Christian Sieblist, Marco Jenzsch, Michael Pohlscheidt, “Equipment characterization to mitigate risks during transfers of cell culture manufacturing processes”, Cytotechnology (2016), 68(4), 1381–1401.
• Cosima Koch, Markus Brandstetter, Patrick Wechselberger, Bettina Lorantfy, Maria Reyes Plata, Stefan Radel, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Ultrasound-Enhanced Attenuated Total Reflection Mid-Infrared Spectroscopy In-Line Probe: Acquisition of Cell Spectra in a Bioreactor”, Analytical Chemistry (2015), 87, 2314−2320.
• Janosch Fagaschewski, Daniel Sellin, Charles Wiedenhöfer, Sven Bohne, Hoc K. Trieu, Lutz Hilterhaus, “Spatially resolved in situ determination of reaction progress using microfluidic systems and FT-IR spectroscopy as a tool for biocatalytic process development”, Bioprocess Biosystems Engineering (2015), 38, 1399–1405.
• Huiquan Wu, Erik Read, Maury White, Brittany Chavez, Kurt Brorson, Cyrus Agarabi, Mansoor Khan, “Real time monitoring of bioreactor mAb IgG3 cell culture process dynamics via Fourier transform infrared spectroscopy: Implications for enabling cell culture process analytical technology”. Frontiers of Chemical Science and Engineering (2015), 9, 386–406.
• Cosima Koch, Andreas Posch, Héctor Goicoechea, Christoph Herwig, Bernhard Lendl, “Multi-analyte quantification in bioprocesses by Fourier-transform-infrared spectroscopy by partial least squares regression and multivariate curve resolution”, Analytica Chimica Acta (2014), 807, 103-110.
• Cornelia Walther, Sabrina Mayer, Alois Jungbauer, Astrid Dürauer, “Getting ready for PAT: Scale up and inline monitoring of protein refolding of Npro fusion proteins”, Process Biochemistry (2014), 49(7), 1113-1121.
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• Patrick Sagmeister, Magdalena Kment , Andrea Meitz , Timo Langemann, Christoph Herwig, “Soft-sensor assisted dynamic investigation of mixed feed bioprocesses”, Process Biochemistry (2013), 48(12), 1839-1847.
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